一种肝素靶酶的筛选方法及其专用多功能微流控芯片技术

一种用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片，由两个分离单元构成；第一个单元分离通道的下游端与第二个单元每个基本分离单元分离通道的上游端十字相接。肝素靶酶过程如下：将蛋白质混合物溶液放在第一个单元进样端的储液池中，将待筛选的肝素溶液放入第二个单元进样端的储液池中；对第一个单元的样品通道和分离通道同时施加电压，使蛋白质分离；当第一个单元的分离峰出现时，再依出峰时间分别对第二个单元逐个施加电压，使蛋白质和肝素混合并电泳分离，进行检测；比较每一个蛋白质峰在混合前后的峰形或峰大小，如有变化，则表明该蛋白质与该肝素有相互作用。本发明专利技术可在一块小小的塑料或玻璃片上，在极短的时间内完成肝素的高效分离分析、肝素－蛋白质相互作用的在线检测及多个靶酶的同时筛选，且具有很高的灵敏度和低的检测限。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物筛选技术，特别提供了一种肝素靶酶的筛选方法及专用多功能微流控芯片。肝素的抗凝活性是因为肝素和抗凝血酶结合，从而使抗凝血酶能更快速地和大多数参与抗凝过程的丝氨酸反应。目前已经发现肝素能和100多种蛋白质结合，这种结合使蛋白质在体内的稳定性增加，并能延长其在体内的半衰期。所以研究肝素和蛋白质的相互作用对药物开发和临床应用都有很重要的意义。目前研究肝素和蛋白质的相互作用主要有以下方法。文献1 Donald H.Atha，et al.Biochemistry，24，6723-6729(1985)，平衡透析法，此方法是将肝素结合蛋白质(抗体)放入透析袋中，这种透析袋能透过肝素(或其他小分子)，然后将此透析袋与一个已知体积且含有1/K(K结合常数)浓度范围的肝素溶液平衡，通过测定透析袋外溶液中肝素的浓度来确定K和n(N结合计量比)。此方法简单，仪器设备也不复杂；并且如果分析物很稳定，它们还可以回收再利用；此方法可做可靠的平衡测定。但是若分析物之间的结合程度较低，则所需样品量很大；另外，该方法很费时，一个简单的实验需要几天甚至几周才能完成。文献2 UlfLindahl，et al.J.Biol.Chem.259，12368-12376(1984)，亲和色谱法，该方法是将蛋白质固定在一个亲和固定相如Sepharose、Affi-GelTM或其它的活性固定相上，然后注入含有肝素的缓冲液，通过分析洗脱曲线，测定结合常数。但该方法只能测定结合常数K；蛋白质与基质的键合稳定，并且必须保持相当活性；若结合常数大，则所需的肝素量大；分析所需的时间长，通常要几个星期甚至几个月。文献3 Ishan Capila，et al.FEBS Letters，446，327-330(1999)，等温滴定量热法(ITC)，是通过测定自由能的变化获得有关结合的信息。此法是将含有肝素的溶液用滴定进样器加到量热池中(量热池中含一定浓度的蛋白质溶液)。同时需做对照实验(将肝素加到不含蛋白质的溶液中)。每次滴加1-3uL，共滴加25次左右，平衡时间约为200s，滴加间隔为300-500s，测定结合产生的热量变化。该方法可测定分析物之间相互作用的所有的主要热力学信息，也优于平衡透析和亲和色谱。但肝素和蛋白质的用量大(＞10mg)，所以应用不广泛。文献4 Fuming Zhang，et al.Anal.Biochem.304，271-273(2002)，表面离子共振生物传感器(SPR)，此方法一般是将肝素或肝素结合蛋白质固定到生物传感器的表面，而结合对象通过此表面，然后测定芯片表面折射率的改变。此方法是近年来用来做分子相互作用较多的方法，既可测定结合常数，也可测定分解常数；而且相对前几种方法分析速度快。但此方法对分析物的要求是要有足够大的分子量，以得到SPR表面基于相互作用而产生的变化；由于表面的非均一性，所以在高分析物浓度下，将使所得的结合常数和分解常数都大大减小；固定物要对表面有一定的保持力，又要保持原有的构型、活性位点及生物活性是较难的；而且此方法是检测折射率变化，灵敏度低。文献5 Niels H.H.Heegaard.J.Mol.Recog.11，141-148(1998)，亲和毛细管电泳(ACE)，一种是将蛋白质和肝素混合进行区带电泳，通过峰形或大小变化来确定二者是否有结合以及结合常数和结合计量比；一种是将蛋白质单独电泳，而将肝素加到运行缓冲液中，通过蛋白质迁移时间的变化确定结合常数。此法具有分离效率高、快速、样品用量少以及可在接近生理条件下操作等优点，也是近年来做分子相互作用时采用较多的方法之一，但此方法的重复性不是很好，灵敏度也不是很高(紫外检测)。本专利技术提供了一种用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片，其特征在于芯片由两个单元构成；第一个单元为一个十字交叉结构的基本分离单元；第二个单元为多个并列的十字交叉结构的基本分离单元；第一个单元分离通道的下游端与第二个单元每个基本分离单元分离通道的上游端十字相接。本专利技术提供的用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片中，为了节约费用以及便于控制，所述第二个单元的基本分离单元分离通道的下游端共同接一个检测口。本专利技术提供的用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片，所述第二个单元的基本分离单元最好为2～100个。基于上述多功能微流控芯片，本专利技术还提供了一种肝素靶酶的筛选方法，其特征在于过程如下将肝素溶液放在第一个单元基本分离单元样品通道进样端的储液池中，将待筛选的蛋白质溶液放入第二个单元基本分离单元样品通道进样端的储液池中；对第一个单元的基本分离单元样品通道和分离通道同时施加电压，使蛋白质分离；当第一个单元的分离峰出现时，再依出峰时间分别对第二个单元中的基本分离单元逐个施加电压，每一个分离峰对应于一个分离单元，使肝素和蛋白质混合并电泳分离，进行检测；比较每一个峰在混合前后的峰形或峰大小，如有变化，则表明肝素与该蛋白质有相互作用。在上述肝素靶酶的筛选方法中，放入第二个单元的蛋白质可以为不同的种类，这样可以同时筛选出很多种靶酶；也可以为同一种，这样可以在分离的同时找出是哪一个肝素片段与该蛋白质发生了相互作用。同样基于上述多功能微流控芯片，本专利技术还提供了另一种肝素靶酶的筛选方法，其特征在于过程如下 将蛋白质混合物溶液放在第一个单元基本分离单元样品通道进样端的储液池中，将待筛选的肝素溶液放入第二个单元基本分离单元样品通道进样端的储液池中；对第一个单元的基本分离单元样品通道和分离通道同时施加电压，使蛋白质分离；当第一个单元的分离峰出现时，再依出峰时间分别对第二个单元中的基本分离单元逐个施加电压，每一个分离峰对应于一个分离单元，使蛋白质和肝素混合并电泳分离，进行检测；比较每一个峰在混合前后的峰形或峰大小，如有变化，则表明该蛋白质与该肝素有相互作用。同样在上述肝素靶酶的筛选方法中，放入第二个单元的肝素可以为不同的种类，这样可以同时筛选出很多种肝素；也可以为同一种，这样可以在分离的同时找出是哪一种蛋白质与该肝素发生了相互作用。本专利技术微流控芯片中所用的基本分离单元为最简单也最常用的，带有四个储液池和十字型交叉通道的分离单元，短通道为样品通道，长通道为分离通道，储液池中放样品的一端为样品通道的进样端，样品通道的另一端为废液端，废液端的储液池装有缓冲液，分离通道上下游端的储液池中均装有缓冲液。微流控芯片技术是当前研究的热门和重点，其主要以分析化学和生物化学为基础，利用微机电加工技术(MEMS)，在硅、玻璃、石英、塑料表面加工出10-100微米的微通道网络，主要以电渗流和电泳流为驱动力，通过改变驱动电压，控制流体在微通道网络中的流动方向和速率，从而实现对目标分析物的采样、稀释、加试剂、富集、萃取、混合、反应、分离、检测等步骤。但是到目前为止微流控芯片用于肝素靶酶筛选尚未见报导，本专利技术创造性的设计了用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片，可实现肝素-蛋白质相互作用的在线检测及多个靶酶的同时筛选，并可同时获得样品结构方面的信息。本专利技术与平衡透析、亲和色谱、等温滴定量热、表面离子共振等这些已经用于肝素-蛋白质相互作用的方法相比，具有快速、灵敏、高效分离，样品用量少等优势，甚至比亲和毛细管电泳的分离时间更短，所用样品量更少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肝素靶酶筛选的多功能微流控芯片，其特征在于芯片由两个单元构成； 第一个单元为一个十字交叉结构的基本分离单元； 第二个单元为多个并列的十字交叉结构的基本分离单元； 第一个单元分离通道的下游端与第二个单元每个基本分离单元分离通道的上游端十字相接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁爱叶，罗勇，王克夷，杜昱光，林炳承，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]