抗人大肠癌单克隆抗体CAb—2轻、重链可变区基因及其应用制造技术

抗人大肠（结肠、直肠）癌单克隆抗体ＣＡｂ－２的重链可变区基因，其具有序列表〈４００〉１的序列，轻链可变区基因，其具有序列表〈４００〉３的序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株抗人大肠癌单克隆抗体CAb-2的轻、重链可变区基因及其所编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌的药物的应用。
技术介绍
大肠癌是危害人群的常见恶性肿瘤。其发病率在欧美高居第二位，在我国排名第三，随着人们饮食结构的不断的调整，其发病率仍有上升趋势。因此研究大肠癌的诊断和治疗具有重要的意义。虽然目前核磁共振，内窥镜技术不断发展，早期大肠癌肿瘤的检出率有所提高，但临床实际检测仍存在假阳、假阴性现象，即敏感性和特异性不能让人满意。临床上大肠癌的确诊都为晚期，即使切除了原发病灶，2年的复发率仍在50％左右，可见早期的发现、诊断和治疗是关键。自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，这些单克隆抗体不仅在疾病的基础研究方面发挥了积极的作用，同时也为多种难治性肿瘤的诊治带来了新的希望。目前，FdA批准用于肿瘤的治疗性抗体已有15种上市，其中针对大肠癌的单抗是靶向17-1A抗原的鼠源性单抗。该类产品进入临床试验均是应用放射性同位素直接标记鼠源性全抗或抗体的F(ab’)2片段。迄今为止，国内外用于大肠癌诊治研究的靶抗原有17-1A，TAG-72，CEA，A33等。在大肠癌单抗的制备方面，多采用传统免疫的方法来制备抗体，即以可溶性物质或培养的大肠癌细胞为免疫原。由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的大肠癌单抗。我们经过长期的大量的克隆筛选，获得了一株对对大肠癌呈现极好反应性和特异性的杂交瘤细胞株CAb-2，其具有较高的应用价值和开发前景。专利技术内容本专利技术的一个目的在于提供抗大肠癌的单克隆抗体CAb-2的重链可变区基因和轻链可变区基因及其编码的多肽，其重组后可表达出特异性识别和结合大肠癌相关抗原的抗体活性片段。本专利技术的另一目的在于所述抗体CAb-2的基因或多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌药物中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种抗大肠癌的单克隆抗体CAb-2的重链和轻链可变区基因。本专利技术所述的抗大肠癌单抗CAb-2重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性CAb-2单抗的杂交瘤细胞株CAb-2中克隆获的。本专利技术人利用设计的一套引物扩增出大肠癌单抗CAb-2的全长轻链及重链Fd基因，经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认所CAb-2重链可变区基因全长为420bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>2所示。所述的CAb-2轻链可变区基因全长为375bp，其核苷酸序列如序列表中<400>3所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，上述两个基因经重组后可表达出特异性识别和结合两株大肠癌细胞SW480，8693的抗体Fab活性片段。对于本专利技术人成功克隆的大肠癌特异性单抗CAb-2抗体轻、重链可变区基因，分别应用因特网上专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还涉及所述单克隆抗体CAb-2的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤药物中的应用。本专利技术人应用一套设计的扩增引物成功地从培养的一株抗大肠癌特异性单抗CAb-2的杂交瘤细胞中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体CAb-2的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤的药物。基于上述CAb-2的轻、重链可变区基因所编码的多肽产物，可以交联上多种效应分子，制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤的药物。附图说明图1为RT-PCR扩增的抗人大肠癌单抗CAb-2轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。(图中M为DL-2000 Marker，1为含有CAb-2重链可变区的FD基因，2为CAb-2的全长轻链基因)。图2为抗人大肠癌单抗CAb-2轻链可变区基因的测序图谱。图3为抗人大肠癌单抗CAb-2重链可变区基因的测序图谱。图4利用获得的CAb-2基因构建Fab抗体表达载体示意图。图5由CAb-2基因构建Fab抗体的细胞(SW480)ELISA。图6由CAb-2基因构建Fab抗体的细胞(SW480)免疫荧光。具体实施例方式(一)抗人大肠癌单抗CAb-2轻、重链可变区基因的克隆所用细胞株为本专利技术人以新鲜的大肠癌组织匀浆免疫小鼠，采用传统的融合方法而获得的一株高亲和力、高特异性的鼠源性抗人大肠细胞癌单抗CAb-2杂交瘤细胞株。其分泌的抗体不与CEA，17-1A，TAG-72，CEA，A33等肿瘤相关抗原结合，是针对一种分子量约为200KD左右的新肿瘤相关糖蛋白抗原。其分泌的抗体分子亚型为IgG1κ。取处于对数生长期的CAb-2杂交瘤细胞(5×106)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用设计的一套引物分别进行扩增出该株大肠癌单抗CAb-2的全长轻链及重链Fd基因。将含有可变区基因(VH，VL)的扩增产物经1％低溶点琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promegaInc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定，参见附图1。需要说明的是，图1中所示的单抗CAb-2的重链FD基因是从信号肽序列位置获得的。CAb-2单抗的轻链可变区基因也是从信号肽位置处扩增的。之后，将目的片段克隆至T载体，测序分析，见附图2，3。Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL 5×dNTPs，2μL 10×缓冲液，0.5μL RNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。PCR扩增反应按常规方法进行以上述产物为模板，分别用5对重链引物和6对轻链引物扩增大肠癌单抗CAb-2的全长轻链、重链Fd基因。反应体系为模板cDNA 2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。设计的CAb-2单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下小鼠重链V区5’端引物VH15’-GGG GAT ATC CAC CAT GG(AG)ATG(CG)AG CTG(TG)GT(CA)AT(CG)CT CT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志南，邢金良，杨向民，张思河，
申请(专利权)人：陈志南，
类型：发明
国别省市：