检测DNA及其类似物的衬底激活试剂盒和方法技术

本发明专利技术目的在于提供一种方便、快速的将ＤＮＡ固定在衬底上的方法和精确检测ＤＮＡ的方法，并且应用本方法固定ＤＮＡ的密度与传统方法同样高。提供了底物激活试剂盒，其包括ｐＨ６的磷酸盐缓冲液，Ｎ－羟基琥珀酰亚胺的溶液Ａ（水溶液）和１－［３－（二甲氨基）丙基］３－乙基碳二亚胺的溶液Ｂ（二噁烷溶液）；提供了检测ＤＮＡ的方法，特征在于将ＤＮＡ点样到用上述激活试剂盒激活的衬底上，然后用荧光标记的ＤＮＡ与点样ＤＮＡ杂交。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在医学、生物化学、分子生物学研究中应用的衬底(substrate)激活试剂盒，也涉及应用该试剂盒检测DNA或蛋白质的方法。
技术介绍
基因分析在分子生物学和生物化学领域得到应用，最近又用于医学领域，比如诊断疾病。最近专利技术了可以固定DNA的衬底，有力的促进了基因分析，该衬底也应用于医学领域以诊断疾病。有一种使DNA固定在衬底上的方法是固定前将聚合物比如聚赖氨酸覆于玻璃载玻片表面或硅衬底上或利用半导体技术如光刻法将DNA合成到衬底上。然而使用聚合物比如聚赖氨酸固定DNA的方法中存在由于DNA的不稳定固定状态而在杂交物形成步骤和漂洗步骤中造成DNA脱落的问题。另一方面，使用半导体技术的方法要用到易出问题又复杂的生产工艺，使得该方法花费颇高。为了解决上面提到的问题，我们已经发现通过化学方法修饰衬底表面即用活性酯，比如N-羟基琥珀酰亚胺酯或对硝基苯酚酯激活就可牢固的固定DNA。但这种化学修饰法需要包括很多化学反应的复杂步骤。另外，即便在衬底点上DNA以后，化学修饰激活的衬底上可能还有有害的活性点的存在。因此，在目标DNA杂交到点样的DNA上后，有害的活性点也容许DNA自身沉积造成DNA精确检测的困难。因而，本专利技术的目的是提供一个在衬底上以简单方式牢固固定DNA的方法，并且具有与传统方法同样高的DNA结合密度，本专利技术也提供了精确探测DNA及其类似物的方法，但克服上面提到的传统DNA固定方法中存在的问题。
技术实现思路
为实现上述目的我们努力工作，最终发现了只需混合两种溶液就可激活衬底。我们还发现，通过在激活衬底和点样DNA或蛋白质之后、杂交以前的一个预杂交步骤中封闭有害的活性点，DNA或蛋白质可以得到精确的检测，从而完成本专利技术。我们还发现在点上样品后的激活(work-up)步骤中进行的干燥和清洗程序中当活性基团充分灭活时，可省略封闭。此外，还发现在杂交或预杂交步骤之前的温育中使用一种胶体溶液(gel solution)可进一步提高DNA或蛋白质的检测精度。依照本专利技术的衬底激活试剂盒主要包括由N-羟基琥珀酰亚胺和磷酸盐缓冲液(pH6)组成的溶液A和由1-3-乙基碳二亚胺组成的溶液B。依照本专利技术的的衬底激活试剂盒的第二个特征在于上述溶液A是浓度从0.01M到5M的磷酸盐缓冲液(pH6)和浓度从1mM到500mM(0.115g/L到57.5g/L)的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。依照本专利技术的衬底激活试剂盒的第三个特征在于上述溶液B是浓度从0.05M到10M(9.59g/L到1918g/L)的1-3-乙基碳二亚胺的二噁烷溶液。依照本专利技术的衬底激活试剂盒的第四个特征在于50％到99％体积百分比的上述溶液A和1％到50％体积百分比的上述溶液B共同使用。依照本专利技术检测DNA或蛋白质的方法，包括在点样DNA或蛋白质至衬底(已用激活试剂盒活化)上后，但在用荧光称记的DNA与所述点样的DNA或蛋白质杂交之前的某一阶段，进行预杂交以封闭衬底表面中除点样位置外的其它位点。依照本专利技术检测DNA或蛋白质的方法特征在于使用与点样至衬底表面的DNA或蛋白质不同的DNA或蛋白质进行预杂交。依照本专利技术检测DNA或蛋白质的方法，包括用激活试剂盒激活衬底的步骤、将DNA或蛋白质点样到已激活的衬底上的点样步骤、点样后衬底的温育或干燥步骤、封闭衬底表面上除点样位置外其他部分的预杂交步骤、将荧光标记的DNA与点样的DNA或蛋白质杂交的杂交步骤和检测杂交位置中荧光位置的步骤。依照本专利技术检测DNA或蛋白质的方法特征在于预杂交步骤是将不同于点样在衬底表面的DNA或蛋白质的DNA或蛋白质固定的过程。附图简述附图说明图1是衬底表面派生成活性酯的示意图。图2展示将DNA固定在衬底表面的大致反应过程。图3展示点样过程。图4是密封盒的截面图。图5展示预杂交过程。图6展示清洗过程。图7展示杂交过程。实施本专利技术的最佳模式以下进一步阐述本专利技术(1)衬底制备本专利技术使用的衬底具有可将DNA片段、蛋白质、肽和类似物牢固固定在其表面的特征，即使衬底经过清洗也不会脱落，并且还具有在荧光灯照射下可观察到清晰的荧光点的特征，这些特征是含有以下步骤的程序的结果在如玻璃、塑料、硅等支持物表面形成处理层，接着用化学修饰的方法连接如DNA探针、蛋白质、肽等生物物质。表面处理层优选由金刚石、软金刚石(soft diamond)、碳基材料或其混合物或其薄层制造，也可用碳化物比如碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、一碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等制造。此处提到的软金刚石通常是指不完全金钢石结构，是金刚石和碳比如类金刚石碳(DLC)以任何比例混合的混合物。此种衬底的例子是通过在玻璃载玻片上形成软金刚石薄膜而形成的衬底。此衬底表面的处理层厚度在1nm到1000nm之间。此衬底的类金刚石碳优选通过电离蒸气沉积法制备，所用气体混合物包括占体积1％到99％的氢气和作为平衡物的占体积99％到1％的甲烷。在此衬底的正面和背面可涂上单层的钛、金、铂、铌、WC等或其复合薄膜作为反射层。反射层的厚度优选在100nm或更厚以确保形成完全均匀的包被膜。厚度在1000nm或更厚尤佳。优选的是，玻璃衬底表面的粗糙程度应在Ra(JIS B 0601)1nm到1000nm之间。此粗糙化的表面由于提高了衬底的表面积而利于固定大量的探针及其类似物并可形成较高的密度。衬底的表面处理层可通过已知的方法制造，例如，微波等离子CVD法、ECRCVD法、IPC法、直流喷射法、ECR喷射法、离子镀法、电弧离子镀法(arc ion plating method)、EB蒸气沉积法、电阻加热蒸气沉积法(resistance heating vapor deposition method)、电离蒸气沉积法、电弧蒸气沉积法、激光蒸气沉积法等。衬底结构的形成不仅可通过在衬底表面附加处理层的方法实现，还可通过结合其他材料的方法实现，这些材料有合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、金属如金、银、铜、铝、钨等、塑料如聚碳酸酯、氟化树脂等、与作为粘合剂的树脂混合的金属粉末或陶瓷粉末。起始材料如金属粉末或陶瓷粉末可以被压模机压制并高温烧结。金刚石与其他物质(如两相物质)的复合物也可用于本方法。衬体的形状并不特别限制，可以是板状、绳状、球形、多边形、粉末等。对衬体表面进一步化学修饰以固定DNA或蛋白质。化学修饰的一个例子是将在烃链末端带有活性酯的基团通过酰胺键固定在支持物表面。此化学修饰促进DNA、蛋白质、肽等生物物质在衬底表面的固定。化学修饰还可以通过用末端带有极性基团的烃基取代固体支持物表面的方法实现，极性基团可以是羟基、羧基、环氧基、氨基、硫羟基、异氰酸盐(或酯)基团等。此类烃基可有如1到12个碳原子，优选1到6个碳原子，可作例子的是以下化合物单羧酸，如甲酸、乙酸、丙酸等；双羧酸如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等；多价羧酸如偏苯三酸等。以上所列中以草酸和琥珀酸为优选。化学修饰还可通过以下步骤实现例如先在氯气中用紫外光照射支持物将支持物表面氯化，然后在氨气中用紫外光照射以进行氨基化，接下来用适当的酰基氯或酸酐羧化。或者可用等离子体代替氯化在氨气中氨基化衬底表面，然后用酰基氯或酸酐羧化完成化学修饰。(2)激活试剂盒依照本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括作为主要成分的溶液Ａ和溶液Ｂ的衬底激活试剂盒，其中，溶液Ａ由Ｎ－羟基琥珀酰亚胺和ＰＨ６的磷酸盐缓冲液组成，溶液Ｂ由１－［３－（二甲氨基）丙基］３－乙基碳二亚胺组成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：冈村浩，丹花通文，山川薰，大场光芳，高木研一，
申请(专利权)人：东洋钢钣株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]