用于检测肾小管细胞损伤的早发的方法和试剂盒，应用ＮＧＡＬ作为早期的尿生物标记物。ＮＧＡＬ是小的分泌的多肽，其为蛋白酶抗性的并因而在肾小管细胞损伤之后容易地在尿中检测到。主要在近端小管细胞中检测到ＮＧＡＬ蛋白表达，其类似于一种分泌蛋白在细胞质中以点状分布。尿中的表观ＮＧＡＬ与肾缺血和肾毒血症的量和持续时间有关，并为肾小管细胞损伤和肾衰竭的诊断特征。ＮＧＡＬ检测也是用于监测药物或其它治疗剂的肾毒性副作用的有用的标记物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
继发于肾小管细胞损伤(包括缺血性损伤或肾毒性损伤)的急性肾功能衰竭(Acute renal failure)(ARF)，尽管在支持疗法中取得重大的进展，仍是临床医学和肾病学(nephrology)中的普遍而具有潜在破坏性的难题，其具有持续的高死亡率和高发病率。几十年来的前期研究已经说明持续的血管收缩、肾小管阻塞、细胞结构和代谢改变和炎症反应在ARF发病机理中的作用。虽然这些研究已经在动物模型中显出可能的治疗手段，但是到人体中平移研究的努力却产生令人失望的结果。其原因可包括肾对于缺血性损伤和肾毒素的多方面的反应，和ARF早期生物标记物的缺乏，造成迟误开始治疗。当患者的血清肌酸酐(creatinine)值或者(1)当基线血清肌酸酐水平小于2.0mg/dL时，增加至少0.5mg/dL；(2)当基线血清肌酸酐水平大于或等于2.0mg/dL时，增加至少1.5mg/dL；或(3)不管基线血清肌酸酐水平为何，作为暴露于放射成像剂(radiographic agent)的结果增加至少0.5mg/dL时，即认为个体患有急性肾功能衰竭。人们相信，在所述的疾病过程中治疗的早期介入会降低与ARF有关的死亡率并缩短各种类型的肾小管细胞损伤的治疗时间，所述的肾小管细胞损伤包括但不限于缺血性和肾毒性肾损伤。肾小管细胞损伤的可靠的早期生物标记物的鉴定对于促进早期治疗干预是有用的，并通过提供肾毒性的指标有助于指导药物开发。检测肾病的传统的实验室方法包括测定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率、尿电解质、尿沉淀物的显微镜检查及放射学研究。这些指标既没有敏感性和特异性，又不能用于该疾病的早期检测。实际上，虽然血清肌酸酐的升高被普遍地认为是检测ARF的“黄金标准(gold standard)”，但是很显然，在血清肌酸酐变化的时间内，肾功能已经丧失50％之多。较早已经描述了少数缺血性肾损伤的尿生物标记物，包括肾损伤分子-1(KIM-1)和半胱氨酸富含蛋白61(Cyr61)。KIM-1是一个涉及肾再生的假定的粘附分子。在缺血-再灌注损伤的大鼠模型中，发现KIM-1在初始损伤后的24-48小时上调，使其成为可靠但有些晚期的标记物。近期研究已经显示，KIM-1可在肾活组织检查中和患有缺血性急性肾小管坏死的患者的尿中检测到。然而，这种检测在已形成确定的缺血性肾损伤的患者中、在该疾病的晚期也已证明。测定尿KIM-1用于检测早期ARF或临床症状不明显的肾损伤的效用还远远没有得到验证。发现所述的蛋白Cyr61为分泌的富含半胱氨酸的蛋白，其可以在缺血性肾损伤后3-6小时的动物模型的尿中检测到。然而，此检测需要生物亲和纯化和应用肝素-琼脂糖珠的浓缩步骤，然后是Western印迹步骤。即使在生物亲和纯化之后，几种非特异性的交叉反应肽是明显的。因此，就特异性以及所述步骤的繁冗特性而言，尿中Cyr61的检测是有问题的。因此，鉴定改进的用于早期缺血性和肾毒性肾损伤的生物标记物仍然有紧迫的需要。
技术实现思路
本专利技术涉及在哺乳动物中检测肾小管细胞损伤的方法，包括以下步骤1)从哺乳动物实验体得到尿样；2)将尿样与肾小管细胞损伤生物标记物的抗体接触，所述的肾小管细胞损伤生物标记物包含NGAL，以允许形成抗体和肾小管细胞损伤生物标记物的复合物；和3)检测所述的抗体-生物标记物复合物。本专利技术涉及监测治疗肾小管细胞损伤的有效性的方法，包括以下步骤1)提供对于正遭受肾小管细胞损伤的哺乳动物实验体的治疗；2)得到至少一种来自所述实验体的治疗后的尿样；和3)在治疗后的尿样中检测肾小管细胞损伤的生物标记物的存在。本专利技术进一步涉及用于在实验体的尿液中检测肾小管细胞损伤的立即或早期发病生物标记物的存在的试剂盒，包括1)用于获得一定量尿样的方法；2)一种介质，其具有附加于其上的能够与肾小管细胞损伤的生物标记物复合的捕获抗体(capture antibody)，所述的生物标记物为NGAL；和3)检测肾小管损伤生物标记物和捕获抗体的复合物的测定法。本专利技术也涉及一种竞争性酶联合的免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒，其用于测定哺乳动物实验体的肾小管细胞损伤的状态，包含对于肾小管细胞损伤生物标记物有特异性的第一抗体，以测定其在所述实验体的尿样中的存在。本专利技术进一步涉及鉴定由一个事件引起的肾小管细胞损伤的程度的方法，包括步骤为1)得到至少一种来自所述哺乳动物实验体的尿样；2)在所述的尿样中检测肾小管细胞损伤的生物标记物的存在。3)相对于所述事件的时间，根据尿样中IRI生物标记物的存在的发生时间，确定肾小管细胞损伤的程度。本专利技术进一步涉及检测哺乳动物中肾小管细胞损伤的方法，包括以下步骤1)得到含有多至1毫升的来自怀疑有肾小管细胞损伤的哺乳动物实验体的第一次尿的尿样；2)将所述的尿样与肾小管细胞损伤的生物标记物的抗体接触，以允许形成抗体和生物标记物的复合物；和3)检测所述的抗体-生物标记物复合物。优选的肾小管细胞损伤生物标记物为NGAL。附图说明图1显示缺血之后小鼠肾NGAL mRNA的诱导。上图显示应用小鼠肌动蛋白和NGAL的引物进行代表性的RT-PCR，其应用自对照(C)小鼠的肾或在如图所示的不同再灌注时间(小时)之后提取的RNA。通道M包含分子量标准标记物。下图显示来自对照物(CON)在不同时间点NGAL mRNA表达的增加倍数。由微阵列(实线)对比RT-PCR(虚线)得到的值是来自至少3次实验的平均+/-标准偏差(SD)。图2A显示单侧缺血之后小鼠肾NGAL蛋白的诱导。上图显示应用完整肾样品进行代表性的Western印迹，所述的肾样品从对照(Con)小鼠中得到或在如图所示的再灌注时间(小时)之后得到，该Western印迹以NGAL的多克隆抗体或微管蛋白的单克隆抗体为探针进行探测(以显示相同的蛋白上样量)。分子量标记物在最左边。下图显示来自对照物(CON)在不同时间点NGAL蛋白表达的增加的倍数。由密度测定(densitometry)得到的值是来自至少3次实验的平均值+/-SD。图2B显示双侧缺血之后小鼠肾NGAL蛋白的诱导。上图显示应用完整肾样品进行代表性的Western印迹，所述的肾样品从对照(Con)小鼠中得到或在如图所示的再灌注时间(小时)之后得到，该Western印迹以NGAL的多克隆抗体或微管蛋白的单克隆抗体作为探针进行探测(以显示相同的蛋白上样量)。分子量标记物在最左边。下图显示来自对照物(CON)在不同时间点NGAL蛋白表达的增加的倍数。由密度测定得到的值是来自至少3次实验的评价+/-SD。图3显示缺血之后小鼠肾NGAL蛋白的诱导。在小鼠肾的冻结切片上得到代表性的免疫组织化学的结果，所述的冻结切片从对照小鼠中得到或在如图所示的不同回流(reflow)时间(小时)之后得到，该操作以NGAL的多克隆抗体为探针进行探测。“G”表示肾血管球。最右边的图是100×放大图，而其它图为20×放大图。图4A显示早期测定患有单侧缺血性ARF的小鼠的尿中的NGAL蛋白。在单侧肾动脉钳夹(clamping)后，在如图所示的再灌注时间(小时)得到的未处理尿样(每个通道1-2μl，对肌酸酐含量归一化)的代表性的Western印迹。分子量标记物在右边显示。该Western印迹以NGAL(上图)或β本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测哺乳动物中肾小管细胞损伤的方法，所述损伤包括缺血性肾损伤和肾毒性损伤，包含以下步骤： １）从哺乳动物实验体得到尿样； ２）将尿样与肾小管细胞损伤生物标记物的抗体接触，所述的生物标记物包含ＮＧＡＬ，以允许形成抗体和生物标记物的复合物；和 ３）检测所述的抗体－生物标记物复合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：普拉塞德德瓦拉简，乔纳森M巴拉施，
申请(专利权)人：儿童医院医疗中心，哥伦比亚大学受托人，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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