一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒，包括包被的二抗、链霉素或双氢链霉素的特异性抗体及酶标链霉素或双氢链霉素。本发明专利技术的检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒为多残留检测试剂盒，链霉素和双氢链霉素的交叉率为１００％；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，牛奶样品用水稀释后可直接测定，猪肉和肾脏经磷酸缓冲液抽提后调ｐＨ即可上样，并且能同时快速检测大批样品；测定方法简单，省时，牛奶样品在１小时之内可得出测定结果；最低检测限达１１．２μｇ／Ｌ，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品链霉素药物残留检测中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留检测分析
中的一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
在牛奶生产中，兽药使用不当将导致奶或奶制品中兽药残留超标。而牛奶是我们日常食品的重要组成和婴幼儿的主要食品，高浓度残留可损害健康。链霉素作为氨基糖甙类抗生素，可用于预防和治疗革兰氏阴性菌和结核杆菌等感染，在奶牛的常见病乳房炎，结核病等都需要链霉素配合治疗，但如果不正确使用，可造成链霉素残留超标。许多研究证明，链霉素可对肾脏和听神经造成不可逆转的损害，长期饮用链霉素残留牛奶，无疑是等于长期服用小剂量的链霉素，有过敏体质的人服用残留链霉素的奶后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。链霉素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物，由于长期大量使用，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。因此我国制定的链霉素最高残留限量，在牛奶中为200μg/L。目前链霉素的传统检验方法采用微生物法和高效液相色谱法。微生物检测法是应用较广泛的方法，常用的有纸片法(PD)和TTC法，但微生物法检验周期长，特异性差，操作复杂，并且PD法和TTC法检测牛奶中链霉素残留的最低检出量仅为1mg/L和0.5mg/L，这远远满足不了我国制定的链霉素最高残留限量要求。高效液相色谱法也是残留检测的重要方法，由于奶样处理中操作比较繁琐，而且奶中链霉素药物残留量少，背景干扰往往很严重，还都需要通过柱前衍生或柱后衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒，包括包被的二抗、链霉素或双氢链霉素的特异性抗体及酶标链霉素或双氢链霉素。其中，所述链霉素药物为链霉素或双氢链霉素。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括A，B，C，D，E，F试剂液、G试剂液、H试剂液、I试剂液、J试剂液、K试剂液、L试剂液。所述A，B，C，D，E，F试剂液为链霉素或双氢链霉素系列浓度标准溶液。所述G试剂液为酶结合物浓缩液，含有0.1-100mg/L的酶标链霉素或双氢链霉素。所述H试剂液为抗体浓缩液，含有蛋白浓度为0.1-100mg/L的链霉素或双氢链霉素的特异性抗体。所述I试剂液为四甲基联苯胺。所述J试剂液为磷酸盐缓冲液。所述K试剂液为柠檬酸缓冲液。所述L试剂液为终止液。所述链霉素或双氢链霉素的特异性抗体可为链霉素或双氢链霉素单克隆抗体或多克隆抗体；所述链霉素或双氢链霉素单克隆抗体或多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体，所述链霉素或双氢链霉素单克隆抗体优选为链霉素或双氢链霉素鼠单克隆抗体，所述链霉素或双氢链霉素多克隆抗体优选为链霉素或双氢链霉素兔多克隆抗体。以上抗体均可用链霉素或双氢链霉素与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、甲状腺球蛋白(TG)或血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白；所述链霉素或双氢链霉素与载体蛋白的偶联物可采用甲醛法、戊二醛法、重氮化法、碳二亚胺法、羧甲基羟胺-碳二亚胺法或多元酸酐法合成。所述二抗可为抗鼠或抗兔抗抗体，优选为羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法、高碘酸钠法或羧甲基羟胺法标记于链霉素或双氢链霉素。可作为固定所述二抗的特异性抗体的载体物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。在优选的条件下，本专利技术的检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒，包括包被的二抗、链霉素特异性抗体及酶标链霉素。本专利技术的检测原理为将二抗吸附于固相载体上，加入样品、链霉素或双氢链霉素特异性抗体和酶标链霉素或双氢链霉素，待测样品中残留的链霉素或双氢链霉素和酶标链霉素或双氢链霉素竞争链霉素或双氢链霉素特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中链霉素或双氢链霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出链霉素或双氢链霉素的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的链霉素或双氢链霉素标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。本专利技术的检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒为多残留检测试剂盒，链霉素和双氢链霉素的交叉率为100％；主要采用ELISA竞争方法定性或定量检测动物组织(猪、鸡、牛、羊的肌肉组织及肝脏、肾脏等)、牛奶等样品中链霉素药物的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，牛奶样品用水稀释后可直接测定，猪肉和肾脏经磷酸缓冲液抽提后调pH即可上样，并且能同时快速检测大批样品；测定方法简单，省时，牛奶样品在1小时之内可得出测定结果；最低检测限达11.2μg/L，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品链霉素药物残留检测中发挥重要作用。具体实施例方式实施例1、抗原及抗体的制备(1)链霉素或双氢链霉素抗原的合成以卵清白蛋白或牛血清白蛋白、或人血清白蛋白为载体，链霉素或双氢链霉素为半抗原，用甲醛法或戊二醛法、或重氮化法、或碳二亚胺法、或羧甲基羟胺-碳二亚胺法、或多元酸酐法，将链霉素或双氢链霉素偶联在卵清白蛋白或牛血清白蛋白、或人血清白蛋白上，得到链霉素或双氢链霉素抗原。(2)链霉素或双氢链霉素兔多克隆抗体的制备采用日本大耳兔作为免疫动物，以步骤(1)中合成的抗原为免疫原，免疫剂量每次为2mg/mL免疫抗原，首次免疫用2mL完全福氏佐剂乳化，加强免疫用2mL不完全福氏佐剂乳化。每次免疫间隔2周，共免疫5-10次，最后一次不加免疫佐剂直接肌肉注射，7天后采血检测，测定血清抗体效价后，颈动脉放血，提取血清，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。(3)链霉素或双氢链霉素鼠单克隆抗体制备采用BALB/C小鼠作为免疫动物，以步骤(1)中合成的抗原为免疫原，剂量为50μg(0.1mL)加等体积完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下多点注射免疫。一月后，取同样量免疫抗原加不完全福氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一月后免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，之后5天采血，测定抗体效价。取脾细胞按4∶1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释或软琼脂平板法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106-5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。定期检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。(4)酶标记链霉素或双氢链霉素的合成用戊二醛法或高碘酸钠法、或羧甲基羟胺法将链霉素或双氢链霉素标记于辣根过氧化物酶上，合成酶标记链霉素。(5)二抗的制备以羊作为免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒，包括包被的二抗、链霉素或双氢链霉素的特异性抗体及酶标链霉素或双氢链霉素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀凌，刘智宏，叶妮，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]