本发明专利技术提供两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽的氨基酸序列及其对日本血吸虫的保护性免疫作用。利用日本血吸虫８５ｋＤａ金属蛋白酶免疫血清筛选噬菌体十二肽库，用噬菌体ＥＬＩＳＡ、ＤＮＡ测序、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、酶活性中和实验等方法对所选取的克隆进行分析，并用动物实验测定其免疫保护效果。结果，随机挑选的１０个克隆经ＥＬＩＳＡ鉴定均为阳性。测序后得到５种不同的氨基酸序列，用表达这５种不同氨基酸序列的噬菌体克隆免疫昆明株小鼠，其中两个克隆能诱导明显的减虫率（分别为３１．０％和３１．８％）和减卵率（分别为５２．６％和５４．９％），为研制新型的日本血吸虫疫苗奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽及其筛选方法和在抗日本血吸虫攻击感染方面的应用，属生物
技术介绍
血吸虫是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，广泛流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的74个国家和地区，约有2亿人受到感染，6亿人受感染威胁。有五种血吸虫可以感染人并引起人体血吸虫病，在我国流行的为日本血吸虫病，该病流行于长江流域及其以南的12个省市自治区，给人们的身体健康和社会的经济发展带来严重危害。长期以来人们一直在探索控制和消灭血吸虫病的有效途径。尽管目前有包括化学药物治疗在内的多种防治措施，但由于消灭钉螺及控制传染源难度极大，血吸虫病至今仍然是亟待解决的一个严重的公共卫生问题，要从根本上控制血吸虫病的流行，必须发展血吸虫病疫苗，因为在人类与疾病抗争的历史进程当中，疫苗一直是控制疾病传播的一大法宝，为人类的健康做出了巨大的贡献。随着生物化学及分子生物学技术的发展，越来越多的血吸虫有效抗原被分离出来，它们在各种动物模型中能诱导出一定的免疫保护力。这些抗原主要为蛋白包括酶类或者糖蛋白，目前有几种被WHO认为血吸虫疫苗候选抗原。随着基因重组技术的出现，人们对血吸虫基因进行重组，用大肠杆菌或酵母菌等进行表达，发展了血吸虫基因工程疫苗以解决天然蛋白的来源不足的问题。随着免疫学的发展，免疫学理论在分子水平上的不断深入，人们已经认识到有效的疫苗反应是由有免疫原性的抗原决定蔟，也就是抗原表位引起的。因此利用具有强免疫原性的血吸虫抗原表位来研制血吸虫疫苗已成为血吸虫疫苗发展的重要途径。在血吸虫体内广泛存在着各种蛋白酶，他们在血吸虫的各个发育阶段都起着重要作用。在这些蛋白酶中，金属蛋白酶有着特殊的作用，除了具有催化蛋白质降解这种一般蛋白酶所具有的功能外，它还对血吸虫入侵宿主和产生免疫逃避有着重要影响。因此，金属蛋白酶可能是一个理想的免疫靶。噬菌体随机库肽技术不仅可以分析和确定蛋白的抗原表位，而且获得的模拟表位不需佐剂也能诱导小鼠产生免疫应答，因此，在新型疫苗研究中备受青睐。本专利技术就是利用抗金属蛋白酶血清筛选噬菌体随机十二肽库来分析抗金属蛋白酶血清IgG与金属蛋白酶抗原表位的结合特异性，分离模拟金属蛋白酶抗原表位的短肽，观察这些短肽在小鼠中诱导抗日本血吸虫感染的免疫效果，为研制新型的日本血吸虫疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽以及提供一种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽的筛选方法。本专利技术的另一目的在于提供该两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽在对日本血吸虫攻击感染的免疫保护作用。本专利技术所述的两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽分别有如下氨基酸序列Ser-Asn-Pro-Pro-Gly-Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Pro-Pro和Ile-Thr-Ser-His-Thr-Gly-Yyr-Leu-Gln-Leu-Arg-Leu本专利技术的筛选方法为用SDS-PAGE从日本血吸虫呕吐物中分离金属蛋白酶，用含85kDa金属蛋白酶的凝胶免疫小鼠，经三次免疫后测定抗体滴度并收集血清，用饱和硫酸铵分级沉淀粗提IgG，在IgG包被板中加入稀释的原始肽库于37℃慢摇以筛选与IgG有特异性结合力的噬菌体；洗涤除去未结合的噬菌体；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.2)室温洗脱，收集洗脱液并测定噬菌体滴度，随机挑选单个噬菌体克隆加入到ER2738菌液中，37℃振荡培养后用TBS悬浮噬菌体，将此悬浮噬菌体作为第二次筛选的起始物，共进行三轮亲和筛选，得到与IgG结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽；用噬菌体ELISA、DNA测序、Westernblot、酶活性中和实验等方法对三轮筛选后所挑取的克隆进行分析，并用动物实验测定其免疫保护效果。本专利技术的日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽可应用于抗血吸虫攻击感染方面。本专利技术提供的日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽具有对日本血吸虫的保护性免疫作用，即用氨基酸序列分别为Ser-Asn-Pro-Pro-Gly-Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Pro-Pro和Ile-Thr-Ser-His-Thr-Gly-Yyr-Leu-Gln-Leu-Arg-Leu的两种噬菌体克隆免疫昆明小鼠，能诱导明显的减虫率(分别为31.0％和31.8％)和减卵率(分别为52.6％和54.9％)。通过对金属蛋白酶模拟多肽的筛选，克服了通过自然途径无法获得或难以获得的金属蛋白酶抗原表位的缺点，使大量获取有效血吸虫抗原成为可能，而且所获得的多肽结构清楚、组成清晰，为人工合成多肽疫苗奠定了基础。附图说明图1为阳性噬菌体克隆的鉴定2为2号和3号噬菌体克隆的Western bolt分析从左至右依次为M13、2号克隆、3号克隆、Marker图3为以明胶为底物的金属蛋白酶活性电泳分析图C正常对照组，孵育液为0.1M pH9.0的Tris-HCl缓冲液；2与2号噬菌体免疫血清孵育过的凝胶； 3与3号噬菌体免疫血清孵育过的凝胶；EEDTA，金属蛋白酶抑制剂，孵育液中加入1.0mM的EDTA；S与金属蛋白酶免疫血清孵育过的凝胶；M13与M13免疫血清孵育过的凝胶。具体实施例方式1、主要材料及其来源(1)噬菌体随机十二肽库(Ph.D-12TMPhage Display Peptide Library，含1.5×1013pfu/ml)和宿主菌ER2738系新英格兰生物实验所(New England BiolabsInc.)产品。(2)辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(HRP-M13Ab)购自Pharmcia公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为Promega公司产品。(3)十二烷基硫酸钠系Serva公司进口分装，甲叉双丙烯酰胺系Fluka公司进口分装，丙烯酰胺系Amresco公司进口分装，标准分子量预染蛋白Marker系新英格兰生物实验所(New England Biolabs Inc.)产品；(4)弗氏完全佐剂系美国Sigma公司产品；电泳仪系美国Bio-Rad公司产品，E960酶标仪系ERMC公司产品。(5)实验动物和尾蚴用于逸放尾蚴的阳性钉螺从江苏省寄生虫病防治研究所购买，雌性昆明小鼠由中南大学实验动物学部提供(6)EDTA储存液的配制溶解2.92克EDTA于10ml蒸馏水中，调pH值至8.0，1ml分装置-20℃。使用时，稀释至工作浓度。(7)台式高速离心机、低温高速离心机系湖南仪器仪表总厂产品。其它试剂系国产分析纯。2、方法与结果(1)菌体肽库的亲和筛选用SDS-PAGE从日本血吸虫呕吐物中分离金属蛋白酶。用含85kDa金属蛋白酶的凝胶免疫小鼠，经三次免疫后测定抗体滴度并收集血清，用饱和硫酸铵分级沉淀粗提纯IgG，测定浓度。用100μl含10μg IgG的包被液(0.1MNaHCO3，pH8.5)包板，4℃湿盒中过液，5％脱脂牛奶(溶于TBS)室温封闭2h，然后加入100μl稀释的原肽库(含1011个噬菌斑形成单位)于37℃慢摇1h。用TBS-T(含0.5％V/V Tween-20的TBS)洗涤8次，以除去未结合的噬菌体。再用0.2M的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.2)每孔100μl室温洗脱8分钟。每孔加入15μl中和液(1MTris-HCl，pH9.1)中和后，收集洗脱液并测定噬菌体滴度。本文档来自技高网...
【技术保护点】
两种日本血吸虫金属蛋白酶模拟多肽，其氨基酸系列分别为Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ和Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｙｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅ ｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：易新元，曾宪芳，唐连飞，袁仕善，
申请(专利权)人：易新元，曾宪芳，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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