鉴定用于细胞附着的配体的高通量方法技术

提供了用于鉴定能够在完整的细胞中产生想要的生物学反应的物质的高通量方法。所述方法包括步骤：提供具有培养表面的容器；根据统计设计将不同的包含单一所述物质的不同混合物放入选择的容器中；和将所述单一物质混合物固定在所述培养表面上。所述方法进一步包括将被固定的物质与完整的细胞接触；和获取表示被接触细胞中想要的生物学反应的数据。所述方法也包括使用获得的数据的统计模建来确定哪种单一物质的混合物和／或这些混合物中的哪种单一物质对在被接触的细胞中产生想要的生物学反应有效。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及高通量筛选方法的领域。特别是，本专利技术涉及高通量筛选方法，所述方法可用于鉴定在细胞中引发想要的生物学反应的单一物质(single agents)的混合物和这些混合物中的单一物质。
技术介绍
已知附着依赖性细胞需要合适的允许细胞附着以使在体外细胞培养中存活的培养基质。一般地，培养基中的蛋白任意地固定在细胞培养基质的表面以形成细胞可以附着的层。细胞表面受体，例如，整联蛋白，例如通过与细胞外基质(ECM)蛋白例如纤连蛋白作用来介导细胞附着至该蛋白层上，所述细胞外基质蛋白存在于该血清蛋白层中并且仍具有生物学活性。当细胞通过细胞表面受体-配体相互作用附着在表面时，在细胞内触发了内部信号传导途径，最终确定所述细胞的命运，例如存活、增殖或分化。与体内生物学过程相反，由于非特异性地和任意地形成的血清蛋白层的原因，使用含于培养基中的血清蛋白将细胞附着在细胞培养基质上的不利方面是信号传导途径被非特异性地和任意地触发。另一个不利方面是被吸附至来自培养基的基质上的蛋白可溶解回培养基中，从而离开表面，其进一步导致基质表面不分明。在其它常规的细胞培养系统中，细胞可附着的蛋白可以蛋白包被(protein coatings)的形式存在，在将细胞加入细胞培养基之前，将所述蛋白包被应用于培养容器。作为包被被吸附至培养表面的蛋白可溶解回培养基中，从而离开培养表面。对于用于在治疗中医治或治疗人疾病的细胞，当细胞保持在体外培养时，希望控制细胞命运例如细胞存活、增殖和分化。因此控制细胞表面受体与存在于体外培养基质上的配体的相互作用是必要的。为了控制细胞表面相互作用，可用不允许细胞附着的多聚物包被合适的培养基质例如聚苯乙烯，即使在培养基中使用血清蛋白时。因此该包被消除了血清蛋白不受控制的和任意的吸附。然后将适合与细胞表面受体相互作用的生物学活性配体固定在该包被上，但同时保持所述配体的生物学活性。该概念是已知的。例如，已知使用透明质酸或algenic酸作为表面包被(coating)，可通过使用导致包被与细胞附着配体之间形成稳定共价键的化学反应将细胞附着配体固定在所述表面包被上。这防止了细胞附着配体溶解和离开表面。此外，所述包被自身不支持细胞附着。这描述于2002年9月30日提交的共同未决的、共同拥有的美国申请10/259,797。已知研究一种被固定的配体和其在某个时刻对某种细胞类型的影响。然而，为了获得想要的细胞命运，很可能需要细胞附着配体和外部因子的混合物。已知大量的细胞附着配体并且其用于细胞附着研究中。因此找到置于细胞培养表面以最优化给定细胞类型的细胞附着的恰当的细胞附着配体或细胞附着配体组合是件繁重的工作。因此，在本领域存在对用于鉴定给定细胞类型的细胞附着配体和/或外部因子的更高通量的方法的需要。这对不能存活或只能通过在常规细胞培养系统中急剧改变其分化状态才能存活的细胞是特别有益的，主要的实例是初级哺乳动物细胞。特别地，在本领域存在对统计实验设计的需要，所述实验设计可用于系统地研究因子混合物之间的相互作用，所述因子是为获得给定的细胞类型的想要的命运所必需的。专利技术概述本专利技术提供了用于鉴定能够在整个细胞中产生目的生物学效应的物质(agent)的高通量方法。特别地，所述方法包括步骤提供具有培养表面的容器；根据统计设计将单一物质的不同的混合物放入选择的容器中；和将该单一物质的混合物固定在培养表面上。所述方法进一步包括将被固定的物质与完整的细胞接触；和获取表示被接触细胞中目的生物学反应的数据。所述方法也包括使用由获得的数据统计模建(statistical modeling)来确定哪种单一物质的混合物和/或这些混合物中的哪种单一物质对在被接触的细胞中产生目的生物学反应有效。附图简述附图说明图1是用于本专利技术的优选的步骤的示意说明图。图2是实例性受试孔的示意说明图。图3是96孔板布局(layout)的示意说明图，其包含单一物质的不同的混合物。通过使用统计设计产生该布局，其中设计中的总因子(generic factor)各代表单一物质。图4是96孔板布局的示意说明图，其包括单一物质的不同的混合物。通过使用统计设计建立该布局图，其中设计中的总因子(genericfactor)各代表物质的混合物。图5是可用于产生本专利技术方法的统计设计的方案的示意说明图。图6是可用于产生本专利技术方法的统计设计的进一步方案的示意说明图。图7是数据表(spreadsheet)，其显示使用图6中的方案产生的96孔板布局的混合设计，其中按存在的因子的数目来分配孔中总的流体体积。图8显示基于图7中的数据表的统计设计建立的96孔板布局。图9是附着在96孔板的孔中的荧光标记的细胞的荧光显微图象，所述96孔板具有图8显示的布局。图10是在分析图9的显微图象后获得的细胞核计数对孔编号的图表。图11是使用来自图6-10的信息的混合模型分析获得的Ln(细胞计数-无血清+1)对来自参照混合物的偏差的图表。图12是使用来自图6-10的信息的混合模型分析获得的Ln(细胞计数-10％血清+1)对来自参照混合物的偏差的图表。图13是显示用于96孔板布局的Plackett-Burman统计设计的数据表。图14显示图13中的统计设计中的因子的鉴定。专利技术详述如此处所定义的，“物质(agent)”是结合细胞并调节靶细胞或组织存活、分化、增殖或成熟的生长效应物分子。用于本专利技术的合适物质的实例包括生长因子、细胞外基质分子、肽、激素和细胞因子。术语“固定物质的材料”此处定义为可用作培养表面和某一物质之间连接的生物相容性多聚物。如此处所定义的，术语“固定”、“被固定的”等是指使物质，即，生长效应物分子固定在培养表面，例如孔表面或包含于孔中的支架的表面。该术语包括所述物质被动吸附至培养表面和所述物质直接或间接地共价附着至培养表面。“因子”是实验中变量的名称，其代表实验从一个试验或运行(run)(针对例如，一个孔)到下一个发生变化的事物。在本专利技术中，“因子”是单一物质或单一物质混合物的总名称(generic name)。根据统计设计将因子组合以在实验中形成不同的混合物。“统计设计”，如此处所定义的是指实验设计，所述设计帮助用户发现产生最优实验结果的可调节变量(即，因子)组合，其显著地减少获得该目的所需的实验次数。本专利技术中，通过使用代表被测物质的总因子名称来产生合适的统计设计。所述设计包括因子水平，所述因子水平可以是因子的量和/或浓度或可被转化成因子的实际量和/或浓度。所述设计也包括被编号的实验运行(run)。实验运行明确说明要被检验的因子的组合和其水平，并且各对应例如多孔板上的单个孔。可将实验运行标绘在总的多孔板上的孔上。如此处所用的，术语“预处理”、“经预处理的”是指在表面或其它基质上加上官能团，所述官能团通过化学作用参与随后与固定物质的材料(即，生物相容性多聚物)形成的共价键。例如，可将微量滴定孔的表面进行氨基-等离子(plasma)处理以产生在其上可连接固定物质的材料的富含胺的表面。如上所述，本专利技术涉及用于鉴定能够在完整细胞中产生想要的生物学反应的物质的高通量方法。该方法包括步骤提供具有培养表面的容器；根据统计设计将单一物质的不同混合物置于选择的容器中；将单一物质的混合物固定至培养表面；和将所述被本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定能够在完整的细胞中产生想要的生物学反应的物质的高通量方法，所述方法包括步骤：（ａ）提供具有培养表面的容器；（ｂ）根据统计设计将包含单一所述物质的不同混合物放入选择的所述容器中；（ｃ）将所述单一物质的混合物固定在所述培养表面上；（ｄ）将所述来自（ｃ）的物质与所述完整的细胞接触；（ｅ）获取表示所述被接触的细胞中的想要的生物学反应的数据；和（ｆ）使用所述获得的数据的统计模建来鉴定哪种所述单一物质的混合物和／或所述混合物中的哪种单一物质对在被接触的细胞中产生所述想要的生物学反应有效。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A利布曼芬松，JA罗利，CH博迪利，MA海达兰，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]