用于产生细胞群体的蛋白表达谱的分析平台和方法技术

本发明专利技术涉及分析平台和用其产生细胞群体的定性和／或定量蛋白表达谱（特别是有差别的蛋白表达谱）的方法，其包含：产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，提供基本上平面的固体支持物，以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于１μｍ的厚度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分析平台和用其产生细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱(特别是有差别的蛋白表达谱)的方法，其包含-产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和-以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。一般背景本专利技术应具体地有助于增加或促进理解药物对生物或组织或细胞集合的药物作用和/或毒理学作用。本专利技术应具体地解决细胞信号传导级联的研究，和对处于它们的原始的或归因于细胞发育过程(且如果适当，归因于修饰这些过程的外部应用的诱导)的翻译后修饰形式的所有种类蛋白的检测。本专利技术应提供非常确定的蛋白表达谱的表征方法(如蛋白印迹)的替代方案，其能实现更高的可能的时间通过量，即特别是处理大量不同的样品或针对应用到上面的许多试剂分析一种或多种样品，并能得出精确的定量结果。对于许多应用领域，需要测定复杂样品中的多种生物上有关的分析物，例如，在诊断方法中，用于测定个体的健康状况，或在药物研究或开发中，用于测定施用生物活性化合物对生物和它的复杂的功能模式的作用。然而，已经一般地最优化了已知的分析型分离方法，以在尽可能短的时间内，分离尽可能大数目的包含在给定样品中的化合物，这是根据给定的理化参数，例如分子量或分子荷质比进行的，生物亲和力有关的测定方法是基于具有最大的可能的特异性的生物的、或生化的或合成的识别元件对复杂内容物样品中的对应的(单个的)目标分析物的高选择性的识别和结合的。因而，许多不同的化合物的测定，需要应用相应大数目的不同的特异性的识别元件。可以在均匀溶液中和在固体支持物表面上，进行基于生物亲和力反应的测定方法。依赖于具体的方法，可能在分析物结合识别元件和任选的其它示踪化合物后，和任选地在该过程不同步骤之间，需要洗涤步骤，以分离识别元件和待测分析物和任选的来自样品剩余部分的其它示踪化合物和任选地应用的其它指示剂之间形成的复合物。现在，相对广泛地使用同时测定样品中的许多不同核酸的方法，它使用固定化到固体支持物的离散的、侧向分隔的测量区中的对应的互补核酸作为识别元件。例如，已知基于普通玻璃或显微镜平板的寡核苷酸阵列是具有非常高的特征密度(普通固体支持物上的测量区密度)的识别元件。例如，在美国专利号5,445,934(AffymaxTechnologies)中，已经描述和要求保护了具有超过1000部件/平方厘米的密度的寡核苷酸阵列。这类方法也已经用于测定核酸的表达谱，但是，该样品一般通过费力的方法进行纯化，并扩增在大多数情况下得到的修饰的核酸样品，即通过诸如聚合酶链反应(PCR)的方法，生化地富集(扩增)待测的分析物分子的数目。最近，还经常描述类似的阵列和基于它的方法，以用于同时测定多种蛋白，例如在美国专利号6,365,418B1中。对这样的用于测定核酸和其它生物聚合物(例如蛋白)的所谓“微阵列”的公开内容，描述了如何将多种特异性的识别元件固定化到离散测量区中，以产生用于分析物识别的阵列，然后与包含分析物(可能是在复杂的混合物中)的待分析样品接触。根据已知的公开内容，在分开的离散测量区中，以尽可能纯的形式提供不同的特异性的识别元件，从而致使普遍的不同的分析物能结合到具有不同的识别元件的测量区。对于这类已知的测定，需要通过在有些情况下非常费力的步骤，富集要以尽可能纯的质量固定化的特异性的识别元件。由于不同的识别元件还在它们的理化性质(例如，它们的极性)方面存在或多或少的差异，所以在它们的最优化的固定化到普通支持物上的离散测量区中的条件方面，也存在相应的差异，所述固定化任选地由粘附促进层介导，例如，通过吸附或通过共价结合。因此，为固定化多种不同的识别元件选择的条件(例如粘附促进层的性质)，几乎不能对于要固定化的所有识别元件都是最佳的，但是通常是在不同的目标识别元件的固定化性质之间折衷。而且，这类测定的缺点是，为了测定特定数目的样品中的分析物，必须在普通支持物或应用不同样品的离散支持物上提供对应数目的离散阵列。对于多种不同的样品的分析，这意味着需要大量的离散阵列，其生产是相对复杂的。例如，已经描述了在合适的解离条件下，固定化的寡核苷酸和在样品中提供的互补寡核苷酸之间形成的杂交体，会高效率地解离，从而“再生”识别表面；但是，几乎不能保证100％再生。在与蛋白的生物亲和力复合物的情况下，复合步骤经常是不可逆的，即不能再生识别表面。因此，需要改进的测定体系，其能同时分析普通支持物上的单个阵列中的多个样品中包含的分析物。为此目的，有用地是在支持物上不固定化不同的特异性的识别元件，而固定化待分析的样品本身，如果可能，直接地固定化，而不经其它预处理，或在尽可能少的预处理步骤后固定化。在下面，这类测定体系应被称作“反向测定体系”。在美国专利号6,316,267中，描述了一种方法，其中例如将多氨基酸(可能在复杂的样品混合物中)应用到固体或“半固体”样品基质上。但是，不在生物亲和力测定中进行检测步骤，而是通过用包含所述公开内容中示例的某些金属复合物的试剂混合物进行染色进行。这显然不是特异性的分析物检测方法。在美国专利号6,287,768中，描述了一种方法，其中分离来自生物样品的不同的待测RNA分子，通过大小分开，沉积到固体支持物上，然后在上面测定，例如在与已知的互补多核苷酸杂交后的杂交测定中。根据该专利的公开内容，如果它们以高度充足的量存在，则可以将待测的且从生物分离的RNA分子直接用于进一步的测定方法，或者必须通过已知的扩增方法(例如，通过聚合酶链反应，“PCR”)，预先扩增它们。尽管在美国专利号6,287,768中提出的方法打开了同时测定来自不同样品的RNA的机会，但它仍然需要许多复杂的样品制备步骤，且特别是从生物样品基质的分离，随后根据分子大小分离样品。考虑到下述事实，即要求保护的方法(其仅仅参照RNA的实例进行描述)至少需要从原始样品基质分离，并根据大小分开生物聚合物，预期在该分离步骤之后和分析步骤之前，相对分子组成会与原始样品的相对分子组成不同。在这里和下面，“相同的相对分子组成”指，要在分析中测定的分析物或它们的修饰形式(如磷酸化的、糖基化的、甲基化的或乙酰化的形式等)(在本专利技术的情况下，指由细胞群体表达的蛋白)的浓度的比率保持不变。在该命名后，当使用该名词时，将忽略在对应的测定方法中不测定的溶剂或基质分子或其它分子的含量的变化。在这些方法中使用的检测步骤通常不足够敏感，以致于可达到样品中的待测分析物所需的检测极限的事实可被视作在所述分析方法中包括所述分离或富集步骤的原因。尤其在蛋白免疫测定的情况下，本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生一种或多种细胞群体的定性和／或定量蛋白表达谱的方法，其包含：　　　　－产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，　　　　－提供基本上平面的固体支持物，　　　　－以稀释的或未稀释的形式，将作为沉积样品的小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，　　　　－应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和　　　　－以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，　　　　其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于１μｍ的厚度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M帕夫拉克，E施克，P奥罗什兰，
申请(专利权)人：拜尔技术服务有限责任公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]