本发明专利技术的主题是用于区分和计数至少２个任选地存在于样品中的、具有特定特征的生物成分（éｌéｍｅｎｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ）群体的方法。本发明专利技术允许通过只使用２种检测工具来明确地检测至少３个生物成分群体，这意味着至少２个生物成分群体可通过同一种检测工具来检测。如果使用３种不同的探针，每种探针识别并结合待检测的生物成分群体之一，使所述探针中的每种探针自身可通过不同的标记物进行检测，所述标记物中的两种标记物呈现出两种具有至少一个共同部分的发射光谱（重叠发射光谱），而第三种标记物呈现出与另外两种标记物基本上没有共同部分的发射光谱（非重叠光谱）；则可实现本发明专利技术。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于区分至少两个细胞群体的方法及其应用 本专利技术涉及通过使用流式细胞术的原理来检测、区分和计数存在于液体中的生物成分"16ments biologiques )的方法，所述方法可 适用于在血液学中常规使用的装置。目前市场上销售的自动血液学分析仪(血液学自动装置)提供了 越来越多的能够分析和分类被分析的成分的可能性。已广泛用于流式细胞术的荧光测量法主要用于通过免疫表型分型 (immunoph^iotypage)对成分进行分类。在常规使用的血液学自动装 置中，其尤其专门用于检测体外活体染料，所述体外活体染料用作用 于定量核酸或其他细胞组分的分子探针。免疫探针在常规血液学中的应用仍未普遍化，尽管在不同的制造 者中，通过少数胚胎试验已看到其的应用前景。例如，BAYER公司(Bayer Diagnostics, Tarrytown， New York, USA)(通过BAYER-TECHNICON H*l)首次提出在淋巴细胞分型中使用 抗体的混合物来确定不同类型的淋巴细胞。在该情况下，不是通过荧 光而是通过测量由对生物素(其本身偶联至抗体)具有高亲和力的抗 生物素蛋白-过氧化物酶化合物所产生的光吸收来进行抗原表达的测 量。所述抗体对于表面分子(CD4、 CD8、 CD2、 CD19)的靶抗原来说是 特异性的，所述表面分子特异于所表征的细胞类型。ABBOTT公司(Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA)的ABBOTT CD4000提出了使用2种荧光波长进行分析，以便尤其 用于实施免疫表型分型。Abbott Laboratories公司的专利WO 98/02727描述了这种类型的装置，从而使得能够使用抗体对全血样品 进行标记。ABBOTT在该专利中详细描述了用于对全血样品实现抗体-抗原反应的装置。简单、快速、有效且特异的表型分型方法必须能够在血液学自动装置类型的非常简单的自动装置中使用，从而使得能够使用有限数目 的检测器进行工作。即使技术学基本上相同，但血液学中常规使用的 自动装置具有与流式细胞仪不同的特征，特别是在测量参数的数目方 面不同，所述测量参数的数目被减少至必需的最低限度，特别是在常 规测量中。此外，由于成本是个非常重要的限制因素，所以装置和它 们所允许进行的分析的简化仅能够提高整体节约。流式细胞术是使得能够同时测量相应于生物成分例如细胞或细胞 器的不同物理特征的多个参数的技术。在液体流中带动生物成分，并 当它们通过光源前面的测量室时该装置记录它们中每一个的行为。该技术实际上是3个系统的组合1) 流体系统允许悬浮液中的生物成分在测量室中在光源前面 一个接一个地通过的层流；2) 光学系统激光束或其他光源以及使得能够选择合适的激发 和发射波长的不同滤光片；3) 电子系统PMT (光电倍增管)或光电二极管，其捕获所发射 出的光，从而允许将其转换至电信号，随后转换至数字信号。总之，光源使得能够产生光，所述光将通过透镜和照亮经过测量 室的生物成分。在与生物成分接触时，部分光散射。该光通过多个透 镜和其他光阑，并聚焦在光电二极管型传感器上，从而产生FSC(前 向散射)的测量结果。该测量结果，在所选择的角度范围内，给出了 关于生物成分的大小的指示。该光的另一部分发生正交偏转，并通过另一组透镜，和一组半反 射镜，以在传感器的范围内进行测量，从而产生SSC(側向散射)信 号。该正交光的测量结果给出了关于生物成分的密度和其粒度(结构) 的指示。最后，可通过与待分析的波长和光信号一样多的光电倍增管或光 电二极管来进行光强度的测量。在细胞计数器中生物成分的通过事先需要这样的步骤，在所述步 骤期间使生物成分可检测从而被对所述生物成分的结构或功能特异的探针所标记，预先使所述探针本身可被检测。当探针的标记物是荧光分子时，后者可吸收在对于其而言特异的 波长范围内的光子(激发光谱)。在如此激发后，焚光分子将返回其 基态，并释放具有更低能量的光子。因此，荧光分子具有对于其而言 特有的激发波长光谱，在所述激发波长光谦中，取决于同样特征性的 发射光镨，它将吸收能量从而以荧光的形式(发射的荧光)再发射之。 发射的荧光波长总是比激发波长更大(更低的频率)。散射信号(FSC， SSC)和荧光信号通过适合的检测器将会被转换 成电信号，随后通过计算机系统进行分析。因此，在流式细胞仪中，荧光波长带通常与所使用的每种探针或 探针混合物相关。因而将每种探针与荧光色素(荧光标记物)偶联， 所述荧光色素的信号在单个荧光通道中进行测量，无论所述荧光色素 被嫁接至一种还是多种类型的探针。除了选自轴向散射(前向散射(Forward Scatter)或FSC )、正 交散射(diffusion orthogonale)(侧向散射(Side Scatter)或 SSC)、通过阻抗观寸量术而得的体积(volume par imp6dancem6tr ie) 等的通常物理参数外，还可通过常规使用具有有限数目的荧光测量通 道的免疫表型分型参数来实现成本降低。合计荧光反应的可能性将使得能够在同一测量通道中表达几种不 同的标记物，因而增加系统的分析能力并从而提高其性价比，无需就 此通过添加测量通道而增加装置的复杂性。当多种探针与相同荧光色素缀合时的困难是分别由不同探针识别 的生物学特征的表达将直接影响发射的荧光的总量。因此，例如，如果生物学特征强烈呈现(例如细胞表面上的抗原)， 那么经标记且结合的探针的量将与所述生物学特征的量成正比。结果， 由所述探针发射的荧光的量(其本身与已结合所述经标记的探针的生 物学特征的量成正比)将提高。平行地，如果同一样品的另一种生物学特征表现微弱，那么由缀 合至相同荧光色素的相应探针所发射的荧光的量将会太低，从而可能不被注意，因为其被第一探针的荧光所掩盖。当然，当使用其他类型的标记物时会遇到相同的困难。本专利技术的一个目的正好是允许通过只使用2种检测工具(moyen) 来清楚而明确地检测至少3种探针。因而，这意味着要通过同一种检 测工具来检测至少2种探针。如果使用3种不同的探针，每种探针识 别并结合待检测的生物成分之一或所述生物成分的特征之一，使所述 探针中的每种探针自身可通过不同的标记物进行检测，所述标记物中 的两种标记物呈现出两种具有至少一个共同部分的发射光谙(重叠发 射光语)，而第三种标记物呈现出与另外两种标记物基本上没有共同 部分的发射光谱(非重叠光谱)；则可实现该目的。通过第一检测工 具测量具有重叠发射光谦的2 (或n)个标记物，通过第二检测工具测 量具有非重叠发射光谱的标记物。因此，本专利技术包括(1) -通过与在同一个检测波段中测量的n种标记物偶联的n种探针的发射产率来平衡抗原表达或细胞特征的差异；(2) -建立一方面来源于第二检测工具的信号与另一方面来源 于第一检测工具的信号之间的比率，以将其用作构成矩阵的轴；(3) -以二维方式组合一方面来源于第(2)项的比率和另一方面 来源于第一检测工具的信号，以便改进图解表示法(representation graphique),并从而改善目的生物成分的表征和定量。根据本专利技术，"生物成分"是指例如真核或原核细胞、细胞群、 细胞碎片。"生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于区分和计数至少２个任选地存在于样品中的、具有特定生物学特征的生物成分群体的方法，其包括 －使用３种不同的探针同时标记所述生物成分群体，所述探针是可通过３种不同的标记物进行检测的或被使得可通过３种不同的标记物进行检测，其中所述标记物中的两种标记物（重叠标记物或ＭＣ）各呈现出发射光谱，所述发射光谱相互重叠，而第三种标记物（非重叠标记物或ＭｎＣ）呈现出不与另外两种标记物的光谱重叠的发射光谱（非重叠发射光谱）； －使用任何合适的工具，在于所述非重叠标记的发射光谱中选择出的检测波段中测量非重叠标记物的总量（ｑＭｎＣ）； －使用任何合适的工具，在对于所述重叠标记物的发射光谱而言共同的检测波段中测量重叠标记物的总量（ｑＭＣ）； －确定非重叠标记物的总量对重叠标记物的总量的比率（Ｒ）［Ｒ＝（ｑＭｎＣ）／（ｑＭＣ）］； －使用任何工具绘制图，所述图显示出作为经由重叠标记物标记的生物成分总量的函数的所述比率（Ｒ）［Ｒ＝ｆ（ｑＭＣ）］；和／或 －使用任何工具，对所述图中存在的生物成分群体进行定量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：F拉孔布，F贝洛克，S弗里埃克，D勒费尔，
申请(专利权)人：奥里巴ABX股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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