PAS化的VEGFR/PDGFR融合蛋白及其在治疗中的用途制造技术

本发明专利技术涉及包含（i）血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的结构域和（ii）血管内皮生长因子受体（VEGFR）的结构域的蛋白质。在优选的实施方案中，所述PDGFR的结构域和VEGFR的结构域通过由脯氨酸，丙氨酸和丝氨酸组成的接头附接。所述PDGFR的结构域和所述VEGFR的结构域也可以通过由脯氨酸和丙氨酸组成的接头附接。本发明专利技术还提供包含所述蛋白质的组合物，以及其治疗用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PAS化的VEGFR/PDGFR融合蛋白及其在治疗中的用途
本专利技术涉及包含(i)血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的结构域和(ii)血管内皮生长因子受体(VEGFR)的结构域的蛋白质。在优选的实施方案中，所述PDGFR的结构域和VEGFR的结构域通过由脯氨酸，丙氨酸和丝氨酸组成的接头附接(attach)。PDGFR的结构域和所述VEGFR的结构域也可以通过由脯氨酸和丙氨酸组成的接头附接。本专利技术还提供包含所述蛋白的组合物，以及其治疗用途。
技术介绍
目前最先进的抗血管生成治疗靶向VEGF通路，其是血管生成的主要必需信号通路，包括癌症和眼部疾病中的病理性血管生成。然而，在具有眼部疾病患者抗VEGF单一疗法的长期结果在某种程度上令人失望(Dugel，2013)，因为长期抗VEGF治疗似乎在一些患者群体中引起疾病抗性，这通常与视力的实质性丧失相关(Rofagha等人，2013；Ying等人，2014；Rosenfeld等，2011)。由于患者玻璃体中VEGF水平变化，提出抗VEGF疗法的那些不良反应者由于较高水平的VEGF，可能需要剂量高得多的抗VEGF药物。然而，一项大型的临床研究(READ-3)1年结果显示使用比常规方案高4倍的剂量没有额外的益处(Nguyen等人，2014；白玉婧等人，2016)。这些观察提示，多种通路涉及眼部疾病中的视网膜和脉络膜新生血管形成。事实上，越来越多的临床和实验室证据表明，除VEGF外，其为新生血管(或湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD；Rosenfeld等人，2006；Heier等人，2012)中的关键因素，PDGF也可能在该疾病的发病机理中起关键作用。实际上，VEGF和PDGF的双重抑制可能比单独靶向VEGF更有效(Robins等人，1994；Benjamin等人，1998；Zehetner等人，2014；Bergers等人，2003；Erber等人，2004；Pachydaki等人，2012)。当不稳定且高度可渗透的血管生长并从脉络膜入侵到视网膜中时，病理状况AMD发生，其中渗漏和出血导致视力的快速丧失(在几周至几个月的时段期间)。在这种情况下，VEGF是已知的血管通透性最有力的诱导剂之一(Carmeliet，2000)，尽管VEGF增加血管通透性的精确机制尚不完全清楚。检查视网膜的出生后重塑的研究提供了VEGF和PDGF在湿性AMD中的重要性的初步线索(Benjamin等人，1998)，而在癌症模型方面的工作为追求用于湿性AMD治疗的抗VEGF/PDGF联合疗法提供了最终推动力(Bergers等人，2003；Erber等人，2004)。抗VEGF单一疗法的患者通常在治疗的前3或4个月内获得视敏度(即视力清晰度)的初步改善，其后是整个研究期间持续的平稳时期(Dugel，2013)。在这前几个月的治疗中，抗VEGF单一疗法主要作用于形成血管壁衬里(innerlining)的有孔(fenestrated)内皮细胞，导致水肿减少，从而导致视敏度的初步改善。然而，此后新生血管复合体的其余部分似乎受到周细胞的保护，所述周细胞覆盖并稳定内皮细管。在这种情况下，认为周细胞使对VEGF抑制有抗性的血管存活，这可能是初始抗VEGF治疗后通常观察到的平稳时期(plateau)的原因(Dugel，2013)。值得注意的是，抗VEGF疗法可能不仅导致内皮细胞凋亡，而且还增强周细胞募集，从而潜在地逆转VEGF抑制的作用(Winkler等人，2004；Pachydaki等人，2012)。临床有用的VEGF阻断剂的库(arsenal)随着时间发展，其中较新世代通过增加对VEGF-A的亲和力和/或其抑制的VEGF同种型(isoforms)和家族成员的数量，提供潜在的改善的抗血管生成活性。原则上，这些阻断剂落入两类：(i)单克隆抗体，可变的链接蛋白(支架)或生物工程化的可溶性受体片段和(ii)VEGFR和相关受体的激酶结构域的小分子抑制剂。FDA批准用于AMD的首批抗VEGF疗法之一是pegaptanib(Macugen)，其是结合并中和VEGF-A165的RNA适体(Gragoudas等人，2004)。采用VEGF中和策略的第一种基于蛋白的疗法是贝伐单抗(Bevacizumab)(Avastin，Genentech)，其是通过其可变区经由抗原识别来阻断所有VEGF同种型的重组人源化抗VEGF抗体。贝伐单抗最早被批准用于治疗转移性结肠直肠癌，非小细胞肺癌和多形性胶质母细胞瘤(Grothey等人，2009；Ferrara等人，2004)。伴随着此类癌症疗法的发展，VEGF被发现也在新生血管性AMD和糖尿病性视网膜病变中起关键作用。从这一概念开始，兰尼单抗(Ranibizumab)(Lucentis，Genentech)是基于贝伐单抗开发的，作为亲和力成熟的抗原结合片段(Fab)，其特别用于玻璃体内施用以治疗血管性眼病，特别是湿性或新生血管形式的AMD(Ferrara等人，2006)，最近也有用于糖尿病性视网膜病变((Stewart,2017))。认为与全尺寸抗体相比，Fab的较小尺寸增强其从玻璃体扩散到视网膜中以及脉络膜中的可能(Ferrara等人，2006)。VEGF-Trap(aflibercept；RegeneronPharmaceuticals)是生物工程化可溶性诱饵受体，其基于与其关联细胞受体VEGFR-1和VEGFR-2的生长因子分子相互作用而结合VEGF-A。VEGF-Trap由全人氨基酸序列组成，所述全人氨基酸序列包含与人IgG1的恒定区(Fc)串联融合的人VEGFR1的第二Ig结构域和人VEGFR2的第三Ig结构域(Holash等人，2002)。因此，VEGF-Trap具有比抗体更广的特异性，不仅识别VEGF-A的多个同种型，而且识别相关的VEGF-B，PlGF(胎盘生长因子)和PlGF2(Papadopoulos等人，2012)，其全部是两种酪氨酸激酶(TK)受体VEGFR-1和VEGFR-2的生理配体。
技术实现思路
尽管迄今描述的试剂的有效性和可用性已被证实，为了改善VEGF靶向和/或克服对现有抗VEGF疗法的抗性，需要另外的且更有效的抗VEGF疗法。目前，维持疾病控制通常需要连续玻璃体内注射VEGF拮抗剂进行长期抑制，而没有一种可用的药物导致脉络膜新生血管膜完全消退。与此一致，不是所有的患者都对治疗有反应，有些发展成为无应答者。理想情况下，新的方法将解决目前的(单一)疗法的所有这些限制。在治疗过程中，无论是内在的还是可调整的，造成VEGF阻塞的关键因素之一是VEGF信号系统的冗余(Giuliano&Pages,2013).其他血管生成因子的表达增加可能会为血管生成提供替代的信号通路，这可能引发VEGF无关的新血管化，并导致对单抗VEGF药物的耐药性。特别是针对多种病理路径的药物的混合，可能会增强治疗的效果，因为它以一种典型的协同作用或一种添加剂的方式来靶向关键的通路。除从VEGF这个靶点角度考虑外，PDGF和PDGFR是多种疾病，特别是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，所述蛋白质包含：/n(i)人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的胞外结构域；和/n(ii)人血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171201 EP 172049686;20171116 CN 20171113658261.蛋白质，所述蛋白质包含：
(i)人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的胞外结构域；和
(ii)人血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外结构域。


2.权利要求1的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域和所述VEGFR的结构域通过由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成的接头附接。


3.权利要求2的蛋白质，其中所述脯氨酸残基占所述接头的多于4％且少于40％。


4.权利要求2或3的蛋白质，其中所述接头具有如下氨基酸序列：
(ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n，其中n为10-100的整数。


5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述接头具有如下氨基酸序列：(ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n，其中n为10-60的整数。


6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述接头具有如下氨基酸序列：(ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n，其中n为10-40的整数。


7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中所述接头其中所述接头具有如下氨基酸序列：(ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n，其中n为10-30的整数。


8.根据权利要求7所述的蛋白质，其中所述接头具有如下氨基酸序列：(ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n，其中n为10、20或30。


9.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述接头具有选自下述氨基酸序列：SEQIDNo.2中显示的氨基酸序列或其中所述接头是由具有如SEQIDNo.1中显示的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽。


10.权利要求1的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域和所述VEGFR的结构域通过由脯氨酸和丙氨酸组成的接头附接。


11.权利要求10的蛋白质，其中所述脯氨酸残基占所述接头的多于约10％且少于约75％。


12.权利要求10或11的蛋白质，其中所述接头具有如下氨基酸序列：
(AAPAAPAPAAPAAPAAPA)n，其中n为10-100的整数。


13.根据权利要求12所述的蛋白质，其中所述接头具有选自下述氨基酸序列：SEQIDNo.70中显示的氨基酸序列或其中所述接头是由具有如SEQIDNo.69中显示的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽。


14.权利要求2-13任一项的蛋白质，其中所述接头具有由约50个至约3000个氨基酸残基组成的氨基酸序列。


15.权利要求1-14任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域包含PDGFR的Ig结构域1至5的一个或多个。


16.权利要求1-15任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域包含PDGFR的Ig结构域1至3的一个或多个。


17.权利要求1-16任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域包含PDGFR的Ig结构域1至3。


18.权利要求1至17中任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域能够结合血小板衍生生长因子(PDGF)。


19.权利要求18的蛋白质，其中所述PDGF是PDGF二聚体。


20.权利要求19的蛋白质，其中所述PDGF二聚体是PDGF同二聚体或PDGF异二聚体。


21.权利要求1至20中任一项的蛋白质，其中所述PDGFR是人PDGFRα。


22.权利要求1至21中任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域包含：
(a)具有如SEQIDNo.4或SEQIDNo.20中显示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)如(a)中定义的蛋白质，其中缺失、插入、添加或取代了1至10个氨基酸；
(c)由具有如SEQIDNo.3或SEQIDNo.19中显示的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽；
(d)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸在严格条件下与如(c)中定义的核酸分子的互补链杂交；
(e)与(a)至(d)中任一项的多肽具有至少70％同一性的多肽；和
(f)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸由于遗传密码而与如(c)或(d)中定义的核酸的核苷酸序列是简并的。


23.权利要求21或22的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域能够结合血小板衍生生长因子(PDGF)，其中所述PDGF是PDGF同二聚体，且其中所述PDGF同二聚体是PDGFA同二聚体、PDGFB同二聚体或PDGFC同二聚体。


24.权利要求21或22的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域能够结合血小板衍生生长因子(PDGF)，其中所述PDGF优选为PDGF异二聚体，且其中所述PDGF异二聚体优选为异二聚体PDGFAB。


25.权利要求1至20中任一项的蛋白质，其中所述PDGFR是人PDGFRβ。


26.权利要求1至20和25中任一项的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域包含：
(a)具有如SEQIDNo.6中显示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)如(a)中定义的蛋白质，其中缺失、插入、添加或取代了1至10个氨基酸；
(c)由具有如SEQIDNo.5中显示的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽；
(d)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸在严格条件下与如(c)中定义的核酸分子的互补链杂交；
(e)与(a)至(d)中任一项的多肽具有至少70％同一性的多肽；和
(f)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸由于遗传密码而与如(c)或(d)中定义的核酸的核苷酸序列是简并的。


27.权利要求25或26的蛋白质，其中所述PDGFR的结构域能够结合血小板衍生生长因子(PDGF)，其中所述PDGF优选为PDGF同二聚体，且其中所述PDGF同二聚体优选为PDGFB同二聚体。


28.权利要求18至27中任一项的蛋白质，其中所述血小板衍生生长因子(PDGF)是人PDGF。


29.权利要求1至28中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域包含VEGFR的Ig结构域1至7的一个或多个。


30.权利要求1至29中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域包含VEGFR的Ig结构域2和/或Ig结构域3。


31.权利要求1至30中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域包含VEGFR的Ig结构域2和Ig结构域3。


32.权利要求1至31中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR是人VEGFR-1或人VEGFR-2。


33.权利要求1至32中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域包含VEGFR-1的Ig结构域2和VEGFR-2的Ig结构域3。


34.权利要求1至33中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域包含：
(a)具有如SEQIDNo.8中显示的氨基酸序列的蛋白；
(b)如(a)中定义的蛋白质，其中缺失、插入、添加或取代了1至10个氨基酸；
(c)由具有如SEQIDNo.7中显示的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽；
(d)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸在严格条件下与如(c)中定义的核酸分子的互补链杂交；
(e)与(a)至(d)中任一项的多肽具有至少70％同一性的多肽；和
(f)具有由核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸由于遗传密码而与如(c)或(d)中定义的核酸的核苷酸序列是简并的。


35.权利要求1至34中任一项的蛋白质，其中所述VEGFR的结构域能够结合血管内皮生长因子(VEGF)。


36.权利要求35的蛋白质，其中所述血管内皮生长因子(VEGF)是VEGF二聚体。


37.权利要求36的蛋白质，其中所述VEGF二聚体是VEGF同二聚体。


38.权利要求37的蛋白质，其中所述VEGF同二聚体是VEGFA同二聚体。


39.权利要求35至38中任一项的蛋白质，其中所述血管内皮生长因子(VEGF)是人VEGF。


40.权利要求1至39中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质是融合蛋白。


41.权利要求1至40中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质包含：
(a)具有如SEQIDNo.16、SEQIDNo.46、SEQIDNo.48、SEQIDNo.50、SEQIDNo.52、SEQIDNo.54、SEQIDNo.56、SEQIDNo.58、SEQIDNo.60、SEQIDNo.62、SEQIDNo.64、SEQIDNo.66或SEQIDNo.68中显示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)如(a)中定义的蛋白质，其中缺失、插入、添加或取代了1至10个氨基酸；
(c)由具有如SEQIDNo.15、SEQIDNo.45、SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：董庆，米凯拉·格宝，
申请(专利权)人：成都苑东生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51