新人源TLR2胞外区段单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种单克隆抗体以及制备方法，所述单克隆抗体是人源TLR2胞外区域编码259‑278位氨基酸的基因序列为靶点的抗体。还公开了单克隆抗体在制备抑制布鲁杆菌疫苗中的应用。该单克隆抗体可以特异性识别TLR2，通过封闭布鲁杆菌入侵宿主细胞的第一道闸门，进而抑制布鲁杆菌疫苗株对人巨噬细胞THP‑1的感染，在抑制布鲁杆菌疫苗株感染的科学研究中具有重要的价值和意义，并且具有广阔的推广前景。

【技术实现步骤摘要】
新人源TLR2胞外区段单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，特别涉及新人源TLR2胞外区段单克隆抗体及其制备方法和应用，具体涉及到新人源TLR2胞外区段编码259-278位氨基酸的基因序列的单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
Toll样受体2(Tolllikereceptor2，TLR2)是Toll样受体(Tolllikereceptor，TLR)家族的成员之一，在病原微生物的识别、入侵和天然免疫的激活等方面发挥重要的作用。TLR2基因序列在不同物种之间高度保守，其蛋白结构和蛋白功能在不同物种之间具有相似性。TLR2是一种细胞膜蛋白，其可以同其他TLR家族成员聚合形成异源二聚体，进而识别来自病原微生物的保守分子，这种识别模式被称为病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)。TLR2被PAMPs激活后，能够进一步激活下游信号通路，从而调控宿主对病原微生物的免疫应答。TLR2被认为可以在细菌脂蛋白的刺激下，介导脂蛋白对宿主细胞凋亡的作用。目前，有相关文献显示：TLR2参与了宿主对布鲁杆菌的识别及免疫应答反应。TLR2和TLR4是布鲁杆菌表面蛋白BCSP31介导的细胞因子表达升高、Th1免疫应答和巨噬细胞调控的重要因子。敲低宿主细胞的TLR2基因后，布鲁杆菌的感染作用显著降低；反之，过表达TLR2后，布鲁杆菌的感染作用显著增强，说明TLR2是布鲁杆菌入侵宿主细胞和介导宿主免疫应答的重要靶点。鉴于膜受体TLR2在病原微生物(布鲁杆菌)识别与感染中的重要作用，现有技术中有将TLR2作为靶点，研发相应的小分子抑制剂，评价了TLR2小分子抑制剂对布鲁杆菌感染的抑制作用。比如：Pragnesh等人以TLR2胞内区的Toll/IL-1receptorresistance(TIR)domains为靶点，利用计算机辅助药物设计方案，设计并合成了一种新的TLR2小分子抑制剂C29(如式Ⅰ)，该研究仅评价了C29对宿主巨噬细胞TLR2信号通路表达的影响、其能够抑制TLR2与MyD88相互作用及下游MAPK通路并抑制TLR2介导的免疫应答，但并没有进行C29抑制布鲁杆菌感染的研究；又如：KuiCheng等人设计并合成了TLR1-TLR2复合物的小分子抑制剂(CU-CPT22),其能够特异性地与合成的三酰脂蛋白(Pam3CSK4)竞争性结合TLR1/2复合体，并抑制TNF-α和IL-1β信号通路，但该研究也没有涉及并探讨CU-CPT22对布鲁杆菌感染的作用。可见，现有的以TLR2为靶点进行抑制剂或抗体研发，大多以TLR2胞内区域与第二信使直接结合的结构为靶点进行设计和研发，其主要目的是抑制细胞内TLR2介导的信号通路，从而抑制细胞免疫应答。而尚没有以TLR2胞外区域为靶点的抗体或抑制剂的研究。TLR2是一种细胞表面膜蛋白，也是布鲁杆菌感染宿主细胞的第一道闸门，是布鲁杆菌多种表面结构蛋白的重要受体，因此，以TLR2胞外区域为靶点研发相关的单克隆抗体，封闭布鲁杆菌入侵宿主细胞的重要通道，在布鲁杆菌感染中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术的目的是提供一种单克隆抗体，以解决上述现有技术存在的问题，以TLR2胞外区域编码259-278位氨基酸的基因序列为靶点制备的抗体，该抗体可以实现封闭布鲁杆菌入侵宿主细胞的重要通道。本专利技术还有一个目的是提供一种单克隆抗体的制备方法，通过此方法可以得到纯化后的单克隆抗体，以便于应用于抑制布鲁杆菌感染中。本专利技术还有一个目的是提供一种单克隆抗体在制备抑制布鲁杆菌疫苗中的应用，应用于抑制布鲁杆菌疫苗株对人巨噬细胞THP-1的感染中。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体是以人源TLR2胞外区域编码259-278位氨基酸的基因序列为靶点的抗体。优选的是，编码的259-278位氨基酸序列为：VKITDESLFQVMKLLNQISG。本专利技术还提供一种所述的单克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：步骤1：免疫小鼠，分离小鼠脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓细胞进行融合，经培养后，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并将初筛得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养；通过有限稀释法克隆扩大培养后的阳性杂交瘤细胞，筛选出OD值高的阳性杂交瘤细胞株；步骤2：将所得的阳性杂交瘤细胞株的细胞上清液，通过小鼠单克隆抗体亚型鉴定试纸条鉴定单抗的亚型；步骤3：在小鼠腹腔内接种步骤2中已鉴定单抗亚型的阳性杂交瘤细胞株，在小鼠腹水液中分离和纯化单克隆抗体。优选的是，步骤1中所述小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓细胞按4：1的密度混合。优选的是，用有限稀释法将获得的阳性杂交瘤细胞连续克隆两次，每次克隆用HT选择性培养基进行培养，克隆7天后进行ELISA筛选，直至单克隆细胞阳性率为100％为止。本专利技术还提供一种所述的单克隆抗体在制备抑制布鲁杆菌的疫苗中的应用。优选的是，应用于抑制布鲁杆菌的疫苗株对人巨噬细胞THP-1的感染中。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术公开的TLR2是一种细胞表面膜蛋白，也是布鲁杆菌感染宿主细胞的第一道闸门，是布鲁杆菌多种表面结构蛋白的重要受体，而本专利技术所述的单克隆抗体，是以TLR2胞外区段编码259-278位氨基酸的基因序列为靶点的抗体，可以特异性识别TLR2，通过封闭布鲁杆菌入侵宿主细胞的第一道闸门，进而抑制布鲁杆菌疫苗株对人巨噬细胞THP-1的感染。在TLR2抗体处理下，布鲁杆菌疫苗株感染THP-1细胞12小时、24小时、48小时和72小时后，布鲁杆菌在宿主细胞内的菌落形成单位(Colony-FormingUnits，CFU)分别为对照组的33.2％、63.2％、85.3％和87.6％，可见，该单克隆当体对于布鲁杆菌具有明显的抑制作用。因此，该单克隆抗体对于抑制布鲁杆菌疫苗株感染人宿主细胞的科学研究中具有重要的价值和意义，并且具有广阔的推广前景。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Raybio小鼠亚型鉴定试纸条；图2为TLR2(259-278aa)单克隆细胞株亚型测定；图3为布鲁杆菌疫苗株M5-90感染人源巨噬细胞THP-1后的胞内生存情况。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是以人源TLR2胞外区域编码259-278位氨基酸的基因序列为靶点的抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是以人源TLR2胞外区域编码259-278位氨基酸的基因序列为靶点的抗体。


2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，编码的259-278位氨基酸序列为：VKITDESLFQVMKLLNQISG。


3.一种如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：免疫小鼠，分离小鼠脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓细胞进行融合，经培养后，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并将初筛得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养；通过有限稀释法克隆扩大培养后的阳性杂交瘤细胞，筛选出OD值高的阳性杂交瘤细胞株；
步骤2：将所得的阳性杂交瘤细胞株的细胞上清液，通过小鼠单克隆抗体亚型鉴定试纸条鉴定单抗的亚型；
步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖斌，李林海，孙朝晖，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区总医院，
类型：发明
国别省市：广东;44