PIK3CA基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了PIK3CA基因突变检测试剂盒，具体的地，本发明专利技术公开了一种检测PIK3CA基因突变的引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，能够对多个PIK3CA基因的突变类型进行检测，本发明专利技术的方法和试剂盒适用于dPCR检测，可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。

PIK3CA gene mutation detection kit

【技术实现步骤摘要】
PIK3CA基因突变检测试剂盒
本专利技术属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本专利技术涉及一种PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒。
技术介绍
磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitalpha，PIK3CA)位于染色体3q26.32上,长92kb，由23个外显子组成，编码IA类磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinases,PI3Ks)的催化亚单位p110α，其主要功能是将4,5-PIP2催化成3,4,5-PIP3作为第二信使结合并激活多胞内靶蛋白。PIK3CA是一个致癌基因，该基因突变时通过PI3K/AKT途径，能持续刺激下游AKT活化，使得成纤维细胞和乳腺上皮细胞持续增殖，抑制细胞凋亡，故此密切关系到肿瘤的发生和发展。乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率逐年上升，且愈加年轻化。据研究报道，约有8-40％乳腺癌患者存在PIK3CA基因突变，是p53突变和HER-2扩增之外最为常见的乳腺癌基因突变，其主要突变热点集中在第9(E542K、E545X)、20(H1047X)号外显子上。石蜡包埋组织样本是临床肿瘤基因突变检测最常用的样本类型，该类样本的检测对检测方法的要求较低，但组织样本的获取难度较大、不能多次采样、具有创伤性，且存在严重的异质性。相比而言，血浆样本可克服取样困难、取样次数限制及异质性等问题，是理想的肿瘤基因检测样本类型。但研究表明，血浆中肿瘤游离核酸占比较低，小于1％，因此对检测技术的灵敏度要求较高。目前PIK3CA基因突变常用的检测包括一代测序(Sanger测序)、高通量测序、荧光定量PCR等检测方法。这些方法均存在灵敏度不佳，仅能对石蜡包埋组织样本进行检测，对血浆中少量的肿瘤游离核酸检测效果较差等缺陷。(1)一代测序技术，Sanger测序主要是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段。从而获得DNA碱基序列。缺点是周期长，费用大，且容易发生交叉污染，灵敏度不高。(2)高通量测序，高通量测序技术是对一代测序的一次革命性改变，其一次能对几十万，甚至几百万条DNA分子进行序列测定，具有通量高、准确度高、灵敏度高等特点，但其成本较高，不适合用于适合单基因突变检测。(3)荧光定量PCR，是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。荧光PCR在检测突变基因突变时，特异性较差，检测灵敏度不佳，不适合用于血浆游离核酸的检测。因此，本领域迫切需要开发能够有效检测血浆中PIK3CA基因突变的技术以满足临床的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测PIK3CA基因突变的引物对集，所述引物对集包括：第一引物对组，所述第一引物对组包括如SEQIDNO.:3所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:4所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：第二引物对组，所述第二引物对组包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:2所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：第三引物对组，所述第三引物对组包括如SEQIDNO.:5所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。本专利技术的第二方面，提供了一种检测PIK3CA基因突变的探针集，所述探针集包括：选自下组的一种或多种突变型探针：SEQIDNO.9、11、12、13、14、15和16；和/或选自下组的一种或多种野生型探针：SEQIDNO.10和17。在另一优选例中，所述探针集包括：选自下组的一种或多种突变型探针：SEQIDNO.7、9、11、12、13、14、15、16、18、19和20；和/或选自下组的一种或多种野生型探针：SEQIDNO.8、10、17和21。在另一优选例中，所述突变型探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述突变型探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述野生型探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述野生型探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述突变型探针标记的荧光报告基团不同于所述野生型探针标记的荧光报告基团。本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、16、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、15、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、14、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内包含第四引物探针混合液，所述第四引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、13、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内包含第五引物探针混合液，所述第五引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、12、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内包含第六引物探针混合液，所述第六引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、11、17所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内包含第七引物探针混合液，所述第七引物探针混合液中包含SEQIDNO：3、4、9、10所示的多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测PIK3CA基因突变的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：/n第一引物对组，所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.:3所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:4所示的反向引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PIK3CA基因突变的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对组，所述第一引物对组包括如SEQIDNO.:3所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:4所示的反向引物。


2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对组，所述第二引物对组包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:2所示的反向引物。


3.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第三引物对组，所述第三引物对组包括如SEQIDNO.:5所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。


4.一种检测PIK3CA基因突变的探针集，其特征在于，所述探针集包括：
选自下组的一种或多种突变型探针：SEQIDNO.9、11、12、13、14、15和16；和/或
选自下组的一种或多种野生型探针：SEQIDNO.10和17。


5.如权利要求4所述的探针集，其特征在于，所述突变型探针的5’端包含有荧光报告基团；所述突变型探针的3’端包含有荧光淬灭基团；和/或
所述野生型探针的5’端包含有荧光报告基团；所述野生型探针的3’端包含有荧光淬灭基团。


6.一种用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。


7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求4所述的探针集。


8.如权利要求6所述的试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，朱小亚，潘翠园，黄志文，徐小解，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44