本发明专利技术提供一种血浆EBV miR‑BART8‑3p的检测引物和探针及应用，属于基因治疗和医学诊断技术领域，具体提供引物和探针序列如SEQ ID NO.2‑4所示，本发明专利技术通过所述引物和探针建立了针对血浆中EBV miR‑BART8‑3p的检测方法，可以有效区分正常人和鼻咽癌患者血浆的表达，由此快速做出对鼻咽癌的诊断，本发明专利技术对于鼻咽癌的诊断、鼻咽癌患者的放疗疗效均有重要意义。
A primer and probe for detection of EBV mir-bart8-3p in plasma and its application
【技术实现步骤摘要】
一种血浆EBVmiR-BART8-3p的检测引物和探针及应用
本专利技术涉及基因治疗和医学诊断
，具体涉及一种血浆生物学标志物EBVmiR-BART8-3p在鼻咽癌患者早期诊断、放疗疗效监测和预后预测的检测方法和应用。
技术介绍
鼻咽癌是中国南方癌症相关死亡的重要原因。鼻咽癌对放疗非常敏感，早期鼻咽癌患者可通过调强放射治疗获得超过90％的5年生存率。然而，超过70％的患者最初被诊断为局部晚期鼻咽癌，且仍有15％至30％的患者因远处转移导致治疗失败。因此，发现简单、有效的肿瘤标志物,以提高鼻咽癌早期诊断率和预测预后能力,是鼻咽癌未来防治的重点工作。鼻咽癌与EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)感染密切相关。因此，可通过检测EBV基因产物来协助鼻咽癌的诊疗。最早传统检测的是EBV抗体，尤其是VCA/IgA，然而VCA/IgA抗体的敏感性和特异性相对较低，而且在接受放疗后，患者体内的VCA/IgA抗体长时间内仍维持在高水平，价值有限。目前，EBV-DNA是临床实践中常用的生物标志物。然而15%的鼻咽癌患者在确诊时EBV-DNA阴性；其次，各个实验室EBV-DNA检测技术和方法不同、EBV-DNA的定量和截值缺乏标准化，限制了其广泛应用。因此，研究鼻咽癌中的新型生物标志物具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的长度约为20～23个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，可参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭转移、免疫逃逸等过程。人鼻咽癌细胞产生两类miRNA：一类是人基因组产生的miRNA；另一类是EBV基因组产生的miRNA（EBVmiR）。EBV编码miRNA的基因组位于BHRF1和BART两个基因簇。目前研究发现EBV共编码22个EBV-miR-BARTs前体，形成44个成熟的miRNA，并且EBV-miR-BARTs大量表达于鼻咽癌组织中，而在正常人鼻咽组织几乎检测不到。然而，鉴于鼻咽癌患者的活检组织少，不易取得，副作用及风险较大，而血浆检测比较简单、方便且易于实施、普及，因此，如果能够通过检测血浆中EBVBARTsmicroRNA，并应用于鼻咽癌的早期诊断、放疗疗效预测及预后判断具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血浆EBVmiR-BART8-3p的检测引物和探针，通过检测血浆中EBVBARTsmicroRNA，并应用于鼻咽癌的早期诊断、放疗疗效预测及预后判断具有重要意义。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术所述的EBVmiR-BART8-3p的序列如SEQIDNo.1所示，具体为GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA。还提供了一种血浆EBVmiR-BART8-3p的检测引物和探针，其序列如下：上游引物为miR-BART8-3p-F：5’-ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，下游引物为miR-BART8-3p-R：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，探针为：5’-CGCACTGGATACGACTCTACG-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。通过所述引物和探针制备获得血浆EBVmiR-BART8-3p检测试剂盒。该试剂盒的检测方法是通过PCR技术检测生物样品中EBVmiR-BART8-3p的表达量。本专利技术的优点在于：虽然目前现有技术中已有关于EBVmiR-BART8-3p作为鼻咽癌标志物的报道，但是其方法无法检测出正常人和鼻咽癌患者血浆中EBVmiR-BART8-3p的表达量区别，同时现有技术中并没有在鼻咽癌患者的放疗前后去检测EBVmiR-BART8-3p的表达。本专利技术所提供的引物、探针、检测方法更有效，更有针对性，对于鼻咽癌的诊断、鼻咽癌患者的放疗疗效均有预测意义，这些均未见报道。同时本专利技术只需要患者200ul的血样本，即可完成检测，简单方便。附图说明图1为健康人群与鼻咽癌患者EBVmiR-BART8-3p表达量。图2为血浆中EBVmiR-BART8-3p诊断鼻咽癌的ROC曲线。图3为鼻咽癌患者放疗前后EBVmiR-BART8-3p表达量的变化。图4a为预后总生存率图。图4b为预后无远处转移生存率图。图4c为预后无进展生存率图。具体实施方式实施例11、前期设计了EBVmiR-BART8-3pF端引物序列共3条，EBVmiR-BART8-3pR端引物序列共4条，EBVmiR-BART8-3p探针P共5条，具体见下表，F、R和P共组合成反应体系60种，随后试验进行筛选。2、以miR-BART8-3pmimic作为RNA，进行cDNA合成，利用TaqMan®SmallRNAAssays将RNA逆转录为cDNA。设置RT阴性组，将miR-BART8-3pmimic替换成等量PCR级别的水，其余成分一样。表1.具体反应体系如下表：反应条件和参数：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，∞4℃，cDNA样本-80℃保存备用。3、探针法检测EBVmiR-BART8-3p表达利用TaqMan®UniversalMasterMixII检测EBVmiR-BART8-3p表达量，按下表组分进行反应液配制。设置PCR阴性组（cDNA替换成等量PCR级别的水，其余成分一样），RT阴性组（cDNA为逆转录RT阴性组的产物）。设置EBVmiR-BART8-3p浓度梯度，从3*108拷贝数至3*101拷贝数，作为标准曲线。表2.具体反应体系如下：反应条件和参数:40个循环数，每个循环：95℃10分钟预变性，95℃15秒变性，60℃退火/延伸。5.根据PCR溶解曲线、RT阴性组值、PCR阴性组值、EBVmiR-BART8-3p标准曲线等筛选最佳的EBVmiR-BART8-3pF端引物、R端引物和探针组合，要求：PCR溶解曲线良好，RT阴性、PCR阴性检测不出或PCR的CT值≥40，标准曲线重复性佳、浓度分布合理。最终经过筛选获得最佳引物和探针组合为如下：上游引物为miR-BART8-3p-F：5’-ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，下游引物为miR-BART8-3p-R：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，探针为：5’-CGCACTGGATACGACTCTACG-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。6.筛选最佳的EBVmiR-BART8-3pF端引物、R端引物和探针在小样本的鼻咽癌和健康志愿者的血浆中进行预实验，进一步确定引物和探针的有效性。7．利用前述获得最佳的EBVmiR-BART8-3pF端引物、R端引物和探针组合进行正式扩大样本检测。检测96例健康体志愿者和205例鼻咽癌患者，其中以1668copie/ml为血浆中EBVm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针，其特征在于：其序列如下：/n上游引物为miR-BART8-3p-F：5’- ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，/n下游引物为miR-BART8-3p-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，/n 探针为：5’- CGCACTGGATACGACTCTACG - 3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。/n
【技术特征摘要】
1.一种血浆EBVmiR-BART8-3p的检测引物和探针，其特征在于：其序列如下：
上游引物为miR-BART8-3p-F：5’-ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，
下游引物为miR-BART8-3p-R：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，
探针为：5’-CGCACTGGATACGACTCTACG-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：林城，潘建基，宗井凤，林可焴，苏颖，陈梦媛，卢天柱，郭巧娟，林少俊，
申请(专利权)人：福建省肿瘤医院福建省肿瘤研究所，福建省癌症防治中心，
类型：发明
国别省市：福建;35
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