本发明专利技术公开了一种针对HBB‑28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB‑28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。所述CRISPR单碱基供体修复体系包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。本发明专利技术的修复体系能用于HBB‑28地中海贫血的治疗。
CRISPR single base donor repair system for hbb-28 thalassemia gene
【技术实现步骤摘要】
针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系
本专利技术涉及CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因治疗领域，本专利技术公开了针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。
技术介绍
β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成a与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。β地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白转录启示区的TATA盒-28点突变(A→G)是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一。据报道，全世界约有4亿地中海贫血症基因携带者。在我国，该疾病好发于南方地区，尤其是广东省境内发生率远远高于其他省份。2012年对广东省21个地市共14332个户籍住院分娩孕妇的筛查研究发现，地贫基因携带率为16.8％，即高达1/6育龄人群携带地贫基因。每例重症地贫患儿的出生给社会和家庭带来的经济负担高达100万到300万元。目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地贫致病基因的传播。随着基因编辑技术的出现与发展，如何利用基因编辑技术对基因突变类型遗传性疾病进行预防与治疗是目前新兴的疾病临床治疗模式。从2011年美国率先提出“迈向精准医学”的倡议后，中国的精准医学也不断向前推进。“精确的基因编辑”是基因编辑技术的核心，也是精准医学的重要体现。开展基于特异性基因突变所致疾病的基因编辑精准治疗，获得更加精准高效的基因编辑是未来疾病治疗的创新方向。CRISPR技术自2012年面世以来，极大地促进了基因编辑在多种疾病包括恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗作用，获得了广泛的临床应用，诸如此类：2016年美国国立卫生研究所批准了从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞输回病人体内，基因修饰后的T细胞将靶向摧毁肿瘤细胞；2018年5月，NATURE杂志报道了通过CAR-T治疗治愈一例患者白血病的病例；在中国，2016年10月首次批准了利用CRISPR开展人体临床试验，来治疗化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者等等。已有报道利用CRISPR治疗地中海贫血：通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者体细胞β珠蛋白基因(hemoglobinsubunitbeta，HBB)缺陷基因，然后将基因编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。2015年本专利技术的申请人在世界上首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异常授精的人类3PN受精卵进行HBB基因编辑修复，观测到CRISPR/Cas9对人胚胎中靶基因切割效率达到51.9％，但同时发现脱靶明显。2017年，本专利技术的申请人再次利用单碱基编辑系统(APOBEC1)以及核移植技术，第一次在人类胚胎中实现了单碱基编辑，成功地对导致β-地中海贫血的一种单核苷酸突变-28位突变进行校正。这种单碱基编辑系统由CRISPR-Cas9的变体与胞嘧啶脱氨酶构成，通过导向RNA直接指向正确DNA位置，用胸腺嘧啶(T)替换鸟嘌呤(C)。基因修复效率仅仅只有23％，并且修复后得到胚胎仍然是嵌合体，被修复的卵裂球也只有20％，很难实现完全治愈，且操作起来复杂繁琐。除此之外，该方法也存在较高的脱靶率。以上几种特征将极大地限制该技术在基因编辑治疗β地中海贫血中的使用。
技术实现思路
基于以上申请者的前期研究，本专利技术的主要目的是提供一种修复效率更高的针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系。本专利技术基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架，利用氨基酸的简并性及密码子优化，设计合成了新的高效精准修复的供体(donor)——在修饰型修复模板(ssODN)上引入无义突变，即突变的碱基并不会引起相应氨基酸的改变，它能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。本专利技术第一技术方案，是一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。进一步，根据第一技术方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系，所述CRISPR/Cas表达质粒包括针对HBB-28型突变位点的sgRNA序列和Cas9序列。所述HBB-28型突变为A到G的单碱基点突变。根据以上所述的CRISPR单碱基供体修复体系，所述CRISPR/Cas表达质粒是将Cas9序列和sgRNA序列克隆到真核表达载体上而构建的真核表达载体质粒。具体的，所述真核表达载体包括PX330、pCDNA3.1、pMXs-IRES和pCDH-EF1-MCS。具体的，所述sgRNA序列由序列表中SEQIDNo:1或SEQIDNo:2所示。进一步，第一方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系中，所述供体是5’和3’端2个碱基被硫代修饰的单链寡核苷酸ssDNA。具体的，所述供体的序列由序列表中SEQIDNo:3所示。本专利技术的第二技术方案是所述的CRISPR单碱基供体修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。进一步，第二方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系应用于真核细胞。具体的，所述真核细胞包括293TT细胞、SiHa细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、MCF7细胞和U2OS细胞。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术及修饰型ssDNA(单链寡核苷酸)，结合阻断再次编辑的氨基酸简并性无义突变，高效精准地靶向治疗人类疾病基因突变。采用以上技术方案，本专利技术针对HBB-28突变的地中海贫血这一转录起始区点突变的常染色体隐性遗传病，构建相应的靶向地中海贫血中该突变位点的CRISPR/Cas表达质粒，进而采用5’和3’端2个碱基硫代修饰的ssDNA(单链寡核苷酸)，并在其中利用氨基酸简并性原理引入阻断再次编辑的无义突变，合成为供体，将CRISPR/Cas表达质粒和供体二者共同转染到细胞中，在以293TT细胞为代表的真核细胞中特异性地诱导HBB-28地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造。本专利技术针对HBB-28地中海贫血基因点突变致病这一单基因遗传病，试验了该高效基因编辑治疗方法的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：/n(1)CRISPR/Cas表达质粒、和/n(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。/n
【技术特征摘要】
1.一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：
(1)CRISPR/Cas表达质粒、和
(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。
2.根据权利要求1所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas表达质粒包括针对HBB-28型突变位点的sgRNA序列和Cas9序列。
3.根据权利要求2所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述HBB-28型突变为A到G的单碱基点突变。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas表达质粒是将Cas9序列和sgRNA序列克隆到真核表达载体上而构建的真核表达载体质粒。
5.根据权利要求4所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述真核表达载体包括PX330、pCDNA3.1、p...
【专利技术属性】
技术研发人员：包煜贤，
申请(专利权)人：广州鼓润医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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