一种荧光探针PCR 法快速检测α/β‑地中海贫血的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及用于荧光探针PCR法快速检测α/β‑地中海贫血的引物和探针的组合，包含所述组合的试剂盒。本发明专利技术还涉及用于所述PCR法的PCR反应液。所述PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分。本发明专利技术提供了所述PCR反应液各成分的最佳配比浓度。本发明专利技术还提供了相关PCR条件。本发明专利技术仅通过一次PCR扩增即可同时对多种疾病基因型进行检测，操作简单，耗时短，结果稳定，特异性强。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及医学检测领域，具体涉及一种荧光探针PCR法快速检测疾病的试剂盒，所述疾病优选为α/β-地中海贫血，以及相关PCR方法。专利技术背景地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一，也是我国长江以南各省发病率最高，影响最大的遗传病之一。地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或点突变使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组分改变，肽链失平衡，导致RBC寿命缩短及过早破坏所致的慢性溶血性贫血。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中α和β地中海贫血是最主要的地中海贫血类型。有研究表明，我国地中海贫血严重的地区是两广、云南、海南、四川、贵州、香港、台湾等，其中广西地中海贫血携带率高达21.73％。α-地中海贫血(α-mediterraneananemia)是由于α-珠蛋白基因的缺失或功能缺陷(点突变)而导致α-珠蛋白链合成障碍所引起的一组溶血性贫血。α-珠蛋白基因为常染色体不完全显性遗传，其位于16号染色体短臂(16P13.33～p13.11～pter)，总长约29kb，包含7个连锁的α类基因或假基因。缺失型α-地中海贫血的分子缺陷包含α-珠蛋白基因在内的DNA片段的大片段缺失，其缺失范围从几kb到100kb以上不等，目前在世界上不同种族中已发现至少有35种此类缺失，其中在中国人中，29种为α-地中海贫血1基因，6种为α-地中海贫血2基因。其中在广西，最常见类型包括右缺(-α3.7)、左缺(-α4.2)和东南亚缺失(--SEA)。非缺失型α-地中海贫血，是由于α-基因核苷酸的“点突变”致基因功能缺陷。目前中国常见的非缺失型α-地中海贫血包括：αConstantSpringα(αCSα)：其为α2基因终止密码突变，使α链延长为172个氨基酸，这种突变基因转录的mRNA不稳定，易被破坏，导致α珠蛋白链合成减少；αQuongSzeα(αQSα)：其为α2基因第125密码子CTG(亮氨酸)突变为CCG(脯氨酸)，导致翻译后肽链不稳定，易被蛋白酶水解；αWestmeadα(αWSα)：其为α2基因第122密码子CAC(组氨酸)突变为CAG(谷氨酰胺)。β-地中海贫血(β-mediterraneananemia)是由于β-珠蛋白基因的缺失或功能缺陷(点突变)而导致β-珠蛋白链合成障碍所引起的溶血性贫血。β-珠蛋白基因为常染色体不完全显性遗传，其位于11号染色体上，每条染色体上有1个基因。多数β-地中海贫血为基因突变所致，目前在全世界已发现了近200多种突变类型，中国人群中共发现约48种，其中常见的6种基因突变(突变位点分别为41-42M、-28M、71-72M、17M、βEM、654M)占90％以上，此外，突变位点31M、14-15M、43M、27/28M、IVS-I-1M、IVS-I-5M、CAPM、IntM、-30M、-29M、-32M在广西、广东等地区为临床少见突变类型。α/β地中海贫血基因检测的常见诊断方法有跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)、溶解曲线法、多重PCR法、多重连接依赖式探针扩增技术MLPA、PCR结合反向点杂交法。现简介如下：(一)跨越断裂点的PCR技术跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)是目前缺失型地中海贫血最常用的检测方法，该法是在缺失基因片段两端分别设计正向引物和反向引物，再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小判断检测样品的基因型。(二)溶解曲线法溶解曲线法是指待检DNA通过Gap-PCR扩增后，加一个溶解曲线的反应程序得到溶解曲线图，获得不同的Tm值，从而判定地中海贫血的基因型。(三)PCR结合反向点杂交法针对突变位点设计特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交，通过显色反应分析突变位点。以上方法的缺点是，溶解曲线法结果判定特异性、准确性差；Gap-PCR和PCR结合反向点杂交法操作步骤繁杂，易造成实验和环境的污染，且不适于大样本量检测。目前α和β地中海贫血尚无有效的治疗方法，但可预防，通过产前筛查和诊断，可减少甚至基本杜绝重型或中间型地中海贫血症胎儿的出生，从而减轻社会和家庭负担，提高出生素质。由于基因诊断取材不受组织器官等特异性限制，怀孕早期的绒毛、中期的羊水、血液样本均可用于检测。如前所述，地中海贫血检测常见诊断方法有跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)、溶解曲线法、多重PCR法、多重连接依赖式探针扩增技术MLPA、PCR结合反向点杂交法，但这些方法费时费力，在检验人员人手不足或样本量很多时，这个缺点就显得非常明显，大大降低了医院检验科的检测效率，无形之中也就增加了成本。专利技术简述本专利技术人经过大量实验研究，出乎意料地发现仅通过一次PCR扩增即可同时对多种疾病基因型进行检测，其操作简单，耗时短，结果稳定，特异性强。因此，本专利技术提供用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血的引物和探针的组合。本专利技术还提供包含上述引物和探针的组合的试剂盒。本专利技术进一步提供包含PCR反应液的试剂盒。所述PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分。本专利技术还提供使用前述任一项所述的试剂盒进行PCR扩增的方法，该方法包括：预反应，预变性，变性，退火，循环扩增，荧光信号采集。所述方法包括：第一步：50℃预反应，2min；第二步：95℃预变性，1min；第三步：95℃变性，15sec，60℃退火，1min，39个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。附图说明图1：应用检测右缺(-α3.7)与左缺(-α4.2)基因型的三对引物及探针的扩增曲线及△Cq值柱形示意图。图2：应用检测东南亚缺失(--SEA)基因型引物及探针的扩增曲线示意图。图3：检测突变型α-地中海贫血基因型的扩增曲线示意图。图4：检测突变型β-地中海贫血基因型的扩增曲线示意图。专利技术详述为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术针对每种基因型设计相应的荧光探针，通过一次PCR扩增同时检测α-地中海贫血常见的3种缺失型、3种突变基因型和17种β突变基因型，具有高度的灵敏性、稳定性、准确性和特异性。本专利技术只需加入待测DNA模板，极大地缩减实验操作步骤，以便于减少污染及适合大样本量检测。在一个方面，本专利技术提供引物和探针的组合，其用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血。目前检测缺失型α-地中海贫血基因型引物的设计主要在缺失位点两侧设计长扩增片段(例如Gap-PCR法)和在α1基因和α2基因保守区域设计引物(例如荧光定量PCR法)，均由单一扩增片段进行基因分型，但本申请设计的缺失型α-地中海贫血(-α3.7和-α4.2)基因型通过两对引物与内参基因比较共同检测进行分析，准确性、特异性更高。针对突变位点，本申请分别设计了正常探针和突变探针，不需要进行熔解曲线分析，且扩增条件与缺失型α-地中海贫血基因型一致。所述引物和探针包括右缺(-α3.7)和左缺(-α4.2)基因型引物及探针的设计，其设计原理为:在右缺(-α3.7)的缺失范围内设计α1引物及探针(α1-F、α1-R和Probe-α1)，在右缺(-α3.7)与左缺(-α4.2)重叠缺失范围内设计α2引物及探针(α2-F、α2-R和Probe-α2)，同时设计内参基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测α/β‑地中海贫血的引物和探针的组合，其包括：检测α‑珠蛋白基因簇中‑α3.7缺失型、‑α4.2缺失型、‑‑SEA缺失型、αCSα突变型、αQSα突变型、αWSα突变型的扩增引物和荧光探针，以及检测β‑珠蛋白基因簇中17种突变型的扩增引物和荧光探针，这17种突变型为41‑42M突变型、‑28M突变型、71‑72M突变型、17M突变型、βEM突变型、654M突变型、31M突变型、14‑15M突变型、43M突变型、27/28M突变型、IVS‑I‑1M突变型、IVS‑I‑5M突变型、CAPM突变型、IntM突变型、‑30M突变型、‑29M突变型、‑32M突变型。

【技术特征摘要】
1.用于检测α/β-地中海贫血的引物和探针的组合，其包括：检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型、-α4.2缺失型、--SEA缺失型、αCSα突变型、αQSα突变型、αWSα突变型的扩增引物和荧光探针，以及检测β-珠蛋白基因簇中17种突变型的扩增引物和荧光探针，这17种突变型为41-42M突变型、-28M突变型、71-72M突变型、17M突变型、βEM突变型、654M突变型、31M突变型、14-15M突变型、43M突变型、27/28M突变型、IVS-I-1M突变型、IVS-I-5M突变型、CAPM突变型、IntM突变型、-30M突变型、-29M突变型、-32M突变型。2.权利要求1所述的组合，其中：检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的正向引物包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的反向引物包含SEQIDNo.2和SEQIDNo.4所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型的探针包含SEQIDNo.5所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中-α4.2缺失型的探针包含SEQIDNo.6所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的正向引物包含SEQIDNo.10所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的反向引物包含SEQIDNo.11所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的探针包含SEQIDNo.12所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正向引物包含SEQIDNo.13所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的反向引物包含SEQIDNo.14所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正向引物包含SEQIDNo.15所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的反向引物包含SEQIDNo.16所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正向引物包含SEQIDNo.17所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的反向引物包含SEQIDNo.18所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正常探针包含SEQIDNo.19所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的突变探针包含SEQIDNo.20所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正常探针包含SEQIDNo.21所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的突变探针包含SEQIDNo.22所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正常探针包含SEQIDNo.23所示的序列；检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的突变探针包含SEQIDNo.24所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正向引物包含SEQIDNo.25所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的反向引物包含SEQIDNo.26所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正向引物包含SEQIDNo.27所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的反向引物包含SEQIDNo.28所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正向引物包含SEQIDNo.29所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的反向引物包含SEQIDNo.30所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正向引物包含SEQIDNo.31所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的反向引物包含SEQIDNo.32所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正向引物包含SEQIDNo.33所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的反向引物包含SEQIDNo.34所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正向引物包含SEQIDNo.35所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的反向引物包含SEQIDNo.36所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正向引物包含SEQIDNo.37所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的反向引物包含SEQIDNo.38所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正向引物包含SEQIDNo.39所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的反向引物包含SEQIDNo.40所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正向引物包含SEQIDNo.41所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的反向引物包含SEQIDNo.42所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正向引物包含SEQIDNo.43所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的反向引物包含SEQIDNo.44所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的正向引物包含SEQIDNo.45所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的反向引物包含SEQIDNo.46所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的正向引物包含SEQIDNo.47所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的反向引物包含SEQIDNo.48所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的正向引物包含SEQIDNo.49所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的反向引物包含SEQIDNo.50所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的正向引物包含SEQIDNo.51所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的反向引物包含SEQIDNo.52所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的正向引物包含SEQIDNo.53所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的反向引物包含SEQIDNo.54所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的正向引物包含SEQIDNo.55所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的反向引物包含SEQIDNo.56所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的正向引物包含SEQIDNo.57所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的反向引物包含SEQIDNo.58所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正常探针包含SEQIDNo.59所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的突变探针包含SEQIDNo.60所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正常探针包含SEQIDNo.61所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的突变探针包含SEQIDNo.62所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正常探针包含SEQIDNo.63所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的突变探针包含SEQIDNo.64所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正常探针包含SEQIDNo.65所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的突变探针包含SEQIDNo.66所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正常探针包含SEQIDNo.67所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的突变探针包含SEQIDNo.68所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正常探针包含SEQIDNo.69所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的突变探针包含SEQIDNo.70所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正常探针包含SEQIDNo.71所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的突变探针包含SEQIDNo.72所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正常探针包含SEQIDNo.73所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的突变探针包含SEQIDNo.74所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正常探针包含SEQIDNo.75所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的突变探针包含SEQIDNo.76所示的序列；检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正常探针包含SEQIDNo.77所示的序列；检测β-珠蛋白基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐成，刘军，蒋承凤，徐金兰，孙莉莉，
申请(专利权)人：桂林优利特医疗电子有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45