用于双样本共建测序文库的Y型接头和双样本共建测序文库的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于双样本共建测序文库的Y型接头和双样本共建测序文库的方法。其中，第一Y型接头包括：第一序列包括依次连接的P5、i5、SP1和N1序列；第二序列包括依次连接的L1和N1c序列；第二Y型接头包括：第三序列包括依次连接的P7、i7、SP2和N2序列；第四序列包括依次连接的L2和N2c序列；L1、L2、N1、N1c、N2和N2c均与illumina接头序列及人基因组序列不同且不互补；N1与N1c互补，N2与N2c互补，且N1与N2和N2c不同且不互补；L1的3’端和L2的5’端序具有互补区域。应用本发明专利技术的技术方案，可以使两个单独建库的样本连接到一起形成一个文库并正常测序。

Y-junction for two sample co construction of sequencing library and method for two sample co construction of sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
用于双样本共建测序文库的Y型接头和双样本共建测序文库的方法
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，涉及一种用于双样本共建测序文库的Y型接头和双样本共建测序文库的方法。
技术介绍
作为基因检测临床转化最为成熟的项目，无创产前检测的方法多种多样：如NGS(NextGenerationSequencing)法、多重PCR法、探针法、数字PCR法和芯片法等等，其中多重PCR法、探针法、数字PCR法和芯片法等方法具有成本低、周期短、灵敏度高等优点，尤其是多重PCR法、芯片法和数字PCR法近年来在检测通量上有了很大提高，但仍无法达到NGS法检测的通量。目前关于这些方法的研究文章较多，也有一些专利文献，但尚未大规模应用。实际临床应用中，普遍采用的还是NGS法。其中，NGS法检测主要包含两个部分：文库构建和高通量测序。文库构建包括：对无创产前检测样本的游离DNA(cfDNA)进行末端修复得到末端被修复的cfDNA，再通过加A反应在双链DNA的3’端添加一个碱基A用于后续连接反应；接着对修复加A后的cfDNA进行接头的连接，这一过程是为了将测序平台对应的接头添加到cfDNA片段的两端便于后续测序；最后，再对连接产物进行扩增富集来达到检测量的需求。目前，对该常规建库流程的改进方法较多，主要集中于对单个样本建库方式(如接头方案、环化扩增等)的改进，目的是为了提高建库效率。高通量测序方面，无创产前样本目前主要采取的是SE35、SE50或SE75策略，即单端35bp、50bp或75bp读长测序，数据量一般为5MReads，平均测序深度约为0.1×。然而，从测序成本方面考虑，单端测序的成本一般高于双端测序，且样本通量不高。以NextSeq500为例，单次检测样本数量最高只有96个，在样本检测需求量大的应用场景中局限性较大。如果无创产前检测在较高通量的测序平台上(如illuminaHiSeqX-ten或NovaSeq6000)使用双端测序(PE测序)，检测样本数量可以提高，单位数据量的成本也可以得到一定的降低，但同时由于分析只需要单端测序数据，造成了另一端数据的浪费。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于双样本共建测序文库的Y型接头和双样本共建测序文库的方法，以提高测序数据的利用率。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于双样本共建测序文库的Y型接头。该Y型接头包括：第一Y型接头和第二Y型接头，其中，第一Y型接头包括：第一序列，包括依次连接的P5、i5、SP1和N1序列，其中，依次连接的P5、i5和SP1即为illuminaY型接头中包含P5的单链核苷酸序列；第二序列，包括依次连接的L1和N1c序列；第二Y型接头包括：第三序列，包括依次连接的P7、i7、SP2和N2序列，其中，依次连接的P7、i7和SP2即为illuminaY型接头中包含P7的单链核苷酸序列；第四序列，包括依次连接的L2和N2c序列；其中，L1、L2、N1、N1c、N2和N2c均与illumina接头序列及人基因组序列不同且不互补；N1与N1c互补，N2与N2c互补，且N1与N2和N2c不同且不互补；L1的3’端和L2的5’端序具有互补区域。进一步地，L1的3’端和L2的5’端序具有15～25bp的互补区域。进一步地，N1、N1c、N2和N2c的长度为10～20bp。进一步地，L1的3’端和L2的5’端序具有20bp的互补区域。进一步地，第一序列和第四序列的3’末端添加碱基T和硫代修饰，第二序列和第三序列的5’末端做磷酸化修饰。进一步地，第一序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，第二序列具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，第三序列具有如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，以及第四序列具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。根据本专利技术的另一个方面，提供一种双样本共建测序文库的方法。该方法包括以下步骤：分别采用不同的接头对两个待测样本进行单样本建库，得到第一测序文库和第二测序文库，其中，用于第一测序文库和第二测序文库构建的接头中具有能够通过PCR扩增将第一测序文库和第二测序文库连接在一起的序列；将第一测序文库和第二测序文库混合，通过PCR扩增将第一测序文库和第二测序文库连接在一起得到双样本测序文库。进一步地，用于第一测序文库和第二测序文库构建的接头中具有互补序列，通过重叠延伸PCR法将第一测序文库和第二测序文库连接在一起。进一步地，采用上述任一种用于双样本共建测序文库的Y型接头进行双样本共建测序文库。进一步地，方法包括：S1，分别采用第一Y型接头和第二Y型接头对两个待测样本进行单样本建库，得到第一测序文库和第二测序文库；S2，将第一测序文库和第二测序文库混合，通过重叠延伸PCR法将第一测序文库和第二测序文库连接在一起得到双样本测序文库。进一步地，S1包括：接头连接步骤，对其中一个待测样本连接第一Y型接头，对另一个待测样本连接第二Y型接头；以及扩增步骤，采用具有P5和L1序列的引物对对连接有第一Y型接头的待测样本进行扩增，得到第一测序文库，采用具有P7和L2序列的引物对对连接有第二Y型接头的待测样本进行扩增，得到第二测序文库。进一步地，具有P5序列的引物具有如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列，具有L1序列的引物具有如SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，具有P7序列的引物具有如SEQIDNO：7所示的核苷酸序列，具有L2序列的引物具有如SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。应用本专利技术的技术方案，可以构建一种双样本测序文库，使两个单独建库的样本连接到一起形成一个文库并正常测序，这样基于双端测序策略(如PE50、PE75、PE100等)的原理，合理利用双端测序数据，在相对较低的测序成本下，能够有效提高样本检测通量、进一步降低单个样本双端测序的成本，可应用于更为广泛的测序场景中。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1中的A示出了illuminaY型接头，图1中的B和C示出了根据本专利技术一典型实施方式的用于双样本共建测序文库的Y型接头结构示意图；图2A和图2B示出了根据本专利技术一典型实施方式的采用本专利技术的用于双样本共建测序文库的Y型接头进行双样本分别构建测序文库的流程示意图；图3示出了根据本专利技术一典型实施方式的采用本专利技术的用于双样本共建测序文库的Y型接头进行双样本共建测序文库的流程示意图；图4A和图4B示出了在本专利技术另一典型实施方式的用于双样本单建测序文库的接头结构示意图及建库流程示意图；图5示出了实施例1中Y5接头单建库片段大小分布结果示意图；图6示出了实施例1中Y7接头单建库片段大小分布结果示意图；以及图7示出了实施例1中Y5和Y7接头共建库片段大小分布结果示意图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于双样本共建测序文库的Y型接头，其特征在于，包括：第一Y型接头和第二Y型接头，其中，所述第一Y型接头包括：/n第一序列，包括依次连接的P5、i5、SP1和N1序列，其中，依次连接的所述P5、所述i5和所述SP1即为illumina Y型接头中包含P5的单链核苷酸序列；/n第二序列，包括依次连接的L1和N1c序列；/n所述第二Y型接头包括：/n第三序列，包括依次连接的P7、i7、SP2和N2序列，其中，依次连接的所述P7、所述i7和所述SP2即为illumina Y型接头中包含P7的单链核苷酸序列；/n第四序列，包括依次连接的L2和N2c序列；/n其中，所述L1、所述L2、所述N1、所述N1c、所述N2和所述N2c均与illumina接头序列及人基因组序列不同且不互补；所述N1与所述N1c互补，所述N2与所述N2c互补，且所述N1与所述N2和所述N2c不同且不互补；所述L1的3’端和所述L2的5’端序具有互补区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于双样本共建测序文库的Y型接头，其特征在于，包括：第一Y型接头和第二Y型接头，其中，所述第一Y型接头包括：
第一序列，包括依次连接的P5、i5、SP1和N1序列，其中，依次连接的所述P5、所述i5和所述SP1即为illuminaY型接头中包含P5的单链核苷酸序列；
第二序列，包括依次连接的L1和N1c序列；
所述第二Y型接头包括：
第三序列，包括依次连接的P7、i7、SP2和N2序列，其中，依次连接的所述P7、所述i7和所述SP2即为illuminaY型接头中包含P7的单链核苷酸序列；
第四序列，包括依次连接的L2和N2c序列；
其中，所述L1、所述L2、所述N1、所述N1c、所述N2和所述N2c均与illumina接头序列及人基因组序列不同且不互补；所述N1与所述N1c互补，所述N2与所述N2c互补，且所述N1与所述N2和所述N2c不同且不互补；所述L1的3’端和所述L2的5’端序具有互补区域。


2.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述L1的3’端和所述L2的5’端序具有15～25bp的互补区域。


3.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述N1、所述N1c、所述N2和所述N2c的长度为10～20bp。


4.根据权利要求2所述的Y型接头，其特征在于，所述L1的3’端和所述L2的5’端序具有20bp的互补区域。


5.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述第一序列和所述第四序列的3’末端添加碱基T和硫代修饰，所述第二序列和所述第三序列的5’末端做磷酸化修饰。


6.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述第一序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述第二序列具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述第三序列具有如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，以及所述第四序列具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。


7.一种双样本共建测序文...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘运超，赵静波，方楠，王晓璐，伍启熹，王建伟，刘倩，唐宇，
申请(专利权)人：北京科迅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11