一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用，所述试剂盒包括P7接头和P5接头、酶组合物或缓冲液，所述酶组合物包括末端修复酶、PCR扩增酶或T4DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合；所述缓冲液包括末端修复缓冲液和/或连接缓冲液。本发明专利技术的试剂盒采用市售的试剂自行配制反应溶液，降低了建库成本，简化了反应程序，将末端修复反应体系和加A反应体系合并在一个体系中，缩减了反应时间，提升了酶连接效率。

A DNA library construction kit, library construction method and application based on Illumina sequencing platform

【技术实现步骤摘要】
一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用
本专利技术属于测序
，涉及一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用。
技术介绍
目前，市面上适用illumina二代测序平台的建库试剂盒主要包括illumina原装试剂盒、KAPAHyperPrepKitplatforms、IDTNanoPrepDNA建库试剂盒和NEBNextUltraIIDNAKit等。采用上述试剂盒构建文库的主要流程如下：对基因组进行片段化处理；对片段化DNA进行末端补平；在补平后的片段两端进行加A反应；采用TA连接方式在片段两端添加接头(NEBNextUltraIIDNAKit则是在片段两端添加U字型接头，并用USER酶将U字型接头打开)；采用AMPureXP磁珠捕获片段，得到添加有接头的目的片段；PCR富集后，采用AMPureXP磁珠纯化PCR产物即可出库。但是，上述建库试剂盒在构建文库时存在以下几个方面的缺陷：(1)建库成本较高：成品试剂盒价格高，导致测序成本大幅上升；(2)实验流程相对耗时：对片段化DNA进行末端补平，在补平后的片段两端进行加A反应，该过程分开进行且耗时较长，例如KAPAHyperPrepKitplatforms进行此步骤约需要1小时；(3)流程繁琐：NEB试剂盒添加的接头为U型接头，添加完接头后需要采用USER酶将U型接头变为Y型接头，实验流程相对繁琐；(4)扩增效率较低：对于样本量较低的样本，建库成功率低。因此，现有的试剂盒仍然难以满足市场上对DNA文库构建多样化的需求，有必要提供一种新的成本低、耗时短、流程简洁、成功率高的建库试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用，所述试剂盒可以降低建库成本，简化程序，缩减反应时间，提升酶连接效率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种DNA文库构建试剂盒，所述试剂盒包括P7接头和P5接头；所述P7接头的核酸序列如SEQIDNO:1～5所示；所述P5接头的核酸序列如SEQIDNO:6～10所示；SEQIDNO:1：5’-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTGATCGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；SEQIDNO:2：5’-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTCTCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；SEQIDNO:3：5’-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGAGCTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；SEQIDNO:4：5’-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGACGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；SEQIDNO:5：5’-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；SEQIDNO:6：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3’；SEQIDNO:7：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGGTACAGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3’；SEQIDNO:8：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACCGTTCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3’；SEQIDNO:9：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAACCGGTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3’；SEQIDNO:10：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACATCGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3’。本专利技术中，如SEQIDNO:6～10所示的核酸序列中的s表示碱基进行了硫代修饰。优选地，所述试剂盒还包括酶组合物和/或缓冲液。优选地，所述酶组合物包括末端修复酶、PCR扩增酶或T4DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述缓冲液包括末端修复缓冲液和/或连接缓冲液。优选地，所述末端修复酶包括T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶或Klenow片段中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.4U/μL，例如可以是0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL或0.4U/μL。优选地，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.05～0.09U/μL，例如可以是0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL或0.09U/μL。优选地，所述TaqDNA聚合酶的工作浓度为0.03～0.07U/μL，例如可以是0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL或0.07U/μL。优选地，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.03U/μL，例如可以是0.01U/μL、0.02U/μL或0.03U/μL。优选地，所述PCR扩增酶包括Q5热启动DNA聚合酶。优选地，所述Q5热启动DNA聚合酶的工作浓度为1×。优选地，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10～30U/μL，例如可以是10U/μL、15U/μL、20U/μL、25U/μL或30U/μL。优选地，所述末端修复缓冲液包括10×T4DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液、PEG8000和超纯水。优选地，所述10×T4DNA连接酶缓冲液包括ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT和超纯水。优选地，所述10×T4DNA连接酶缓冲液的工作浓度为0.8～2×，例如可以是0.8×、1×、1.2×、1.5×、1.8×或2×。优选地，所述dNTP混合液的工作浓度为0.3～0.6mM，例如可以是0.3mM、0.4mM、0.5mM或0.6mM。优选地，所述PEG8000的工作浓度为5～10wt％，例如可以是5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％或10wt％。优选地，所述连接缓冲液包括ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、PEG8000、DMSO和超纯水。优选地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括P7接头和P5接头；/n所述P7接头的核酸序列如SEQ ID NO:1～5所示；/n所述P5接头的核酸序列如SEQ ID NO:6～10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括P7接头和P5接头；
所述P7接头的核酸序列如SEQIDNO:1～5所示；
所述P5接头的核酸序列如SEQIDNO:6～10所示。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶组合物和/或缓冲液；
优选地，所述酶组合物包括末端修复酶、PCR扩增酶或T4DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液包括末端修复缓冲液和/或连接缓冲液。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述末端修复酶包括T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶或Klenow片段中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.4U/μL；
优选地，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.05～0.09U/μL；
优选地，所述TaqDNA聚合酶的工作浓度为0.03～0.07U/μL；
优选地，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.03U/μL。


4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增酶包括Q5热启动DNA聚合酶；
优选地，所述Q5热启动DNA聚合酶的工作浓度为1×；
优选地，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10～30U/μL。


5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述末端修复缓冲液包括10×T4DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液、PEG8000和超纯水；
优选地，所述10×T4DNA连接酶缓冲液包括ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT和超纯水；
优选地，所述10×T4DNA连接酶缓冲液的工作浓度为0.8～2×；
优选地，所述dNTP混合液的工作浓度为0.3～0.6mM；
优选地，所述PEG8000的工作浓度为5～10wt％。


6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述连接缓冲液包括ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、PEG8000、DMSO和超纯水；
优选地，所述ATP的工作浓度为0.1～...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江辉，马焕班，卢超，吕艳花，王伟凤，
申请(专利权)人：江西海普洛斯医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36