构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒技术

本公开提供了一种构建mRNA链特异文库的方法，其包括：将mRNA片段、放线菌素D、第一混合酶液和第一缓冲液混合成第一反应体系，使第一反应体系进行第一热处理，获得第一反应液；将第一反应液与第二混合酶液和第二缓冲液混合成第二反应体系，使第二反应体系进行第二热处理，获得第二反应液；将第二反应液与T4DNA连接酶、第三缓冲液和Y字型接头混合成第三反应体系，使第三反应体系进行第三热处理，第三热处理后纯化获得第三反应液；并且在第三反应液中添加预混液、扩增引物和UDG酶混合成第四反应体系，使第四反应体系进行第四热处理，第四热处理后纯化获得mRNA链特异文库。根据本公开能够提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。

Method and kit for construction of mRNA chain specific library

【技术实现步骤摘要】
构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒
本公开特别涉及一种构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。
技术介绍
mRNA链特异文库是能够保留转录本的方向信息的测序文库，测序得到的转录本序列信息均来源于一条链，能够用于确定转录本来源于正义链还是反义链，因此，与普通的转录组测序文库相比，mRNA链特异文库的准确性更高。目前，构建mRNA链特异文库的流程为mRNA的富集，然后将mRNA进行片段化处理，反转录合成第一链，加入dUTP进行第二链合成，再对cDNA产物进行纯化，之后依次是双链cDNA末端修复和加A反应，接头连接，连接产物纯化和片段化筛选，USER酶处理、PCR扩增和纯化等步骤，然而，该构建流程存在步骤繁杂且耗时长，文库构建效率低等问题。
技术实现思路
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒。为此，本公开一方面提供了一种构建mRNA链特异文库的方法，其包括：准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物；将所述第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-BDNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；将所述第二反应液与T4DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。在本公开中，在第一反应体系中，放线菌素D在合成cDNA第一链的过程中能够抑制cDNA第二链的合成，从而有助于提高mRNA链特异文库的链特异性，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，而且在第二反应体系中，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-BDNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段能够协同作用，并且能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率，由此能够有助于提高mRNA链特异文库构建的效率，而且使用含dUTP的第二dNTP作为原料能够标记cDNA第二链，便于后续利用尿嘧啶DNA糖基酶降解cDNA第二链，以形成mRNA链特异文库。此外，在接头连接反应中使用Y字型接头能够提高连接效率，从而有助于提高mRNA文库构建的效率。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL。由此，能够有效提高cDNA第一链合成的效率。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，在所述第二反应体系中，所述DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，所述Taq-BDNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，能够有效提高第二反应体系内的反应效率。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。在这种情况下，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。在这种情况下，第二缓冲液能够保持第二反应体系的pH以及酶的稳定性。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物。由此，能够获得合适长度的mRNA片段，并且能够提供后续合成cDNA第一链所需的随机六聚体引物。另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA链特异文库的方法中，可选地，所述第三缓冲液还包括ATP，Tris-HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000，在所述第三反应体系中，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10U/μL至30U/μL；所述Y字型接头的工作浓度为1×10-7M至3×10-7M；所述二甲基亚砜的工作浓度为1％至1.5％，所述ATP的工作浓度为1.5mM至3mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.04M至0.08M，所述氯化镁的工作浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建mRNA链特异文库的方法，其特征在于：/n包括：/n准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物；/n将所述第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；/n将所述第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且/n在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。/n...

【技术特征摘要】
1.一种构建mRNA链特异文库的方法，其特征在于：
包括：
准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物；
将所述第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-BDNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；
将所述第二反应液与T4DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且
在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
在所述第二反应体系中，所述DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，所述Taq-BDNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。


4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，
在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。


5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于：
所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；
在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物。


7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述第三缓冲液还包括ATP，Tris-HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000，
在所述第三反应体系中，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10U/μL至30U/μL；所述Y字型接头的工作浓度为1×10-7M至...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢超，刘江辉，马焕班，吕艳花，赖国荣，
申请(专利权)人：江西海普洛斯医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36