提高建库效率的构建mRNA文库的方法技术

本公开提供了一种提高建库效率的构建mRNA文库的方法，其包括：cDNA第一链合成步骤；cDNA第二链合成、末端修复和末端加A步骤；接头连接步骤以及文库扩增步骤，其中，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A步骤均在第二反应体系中进行，对第二反应体进行第二热处理并获得cDNA，第二反应体系包括cDNA第一链、DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq

【技术实现步骤摘要】
提高建库效率的构建mRNA文库的方法
[0001]本申请是申请日为2019年12月03日、申请号为201911222706.1、专利技术名称为构建mRNA文库的方法及试剂盒的专利申请的分案申请。


[0002]本公开涉及生物医学工程产业，具体涉及一种提高建库效率的构建mRNA文库的方法。

技术介绍

[0003]转录组测序(RNA
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seq)是利用新一代测序技术全面快速地获得特定细胞或组织在某一状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息的测序技术。基于研究方向及策略的不同，转录组测序分为针对编码蛋白质的mRNA
‑
seq和各种非编码RNA的Ribo
‑
zero RNA
‑
seq。
[0004]目前，构建mRNA
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seq文库的主要流程包括mRNA的富集，然后将mRNA进行片段化处理，经过一链、二链反转录合成双链(cDNA16℃，1h)，再对cDNA产物进行纯化(约30min)，之后依次是双链cDNA末端修复和加A反应(20℃，15min；65℃，15min)，接头连接，连接产物纯化和片段化筛选，PCR扩增和纯化等步骤，然而，该构建流程存在步骤繁杂且耗时长，文库构建效率低等问题。

技术实现思路

[0005]本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种有利于提高建库效率的构建mRNA文库的方法及试剂盒。
[0006]为此，本公开一方面提供了一种构建mRNA文库的方法，其包括：准备mRNA片段、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以所述mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶；将所述第一反应液与具有DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq
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B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以所述cDNA第一链为模板合成cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性；将所述第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液和扩增引物混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使cDNA发生扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA文库。
[0007]在本公开中，在第一反应体系中，RNA酶抑制剂能够避免mRNA被降解，核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶能够提高cDNA第一链合成的产量，由此能够提高cDNA第一链合成的效率。另外，cDNA第二链合成、末端修复和末端加A均在第二反应体系中进行，而且在第二反应体系中，DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq
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B DNA聚合酶以及缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的Klenow片段能够协同作用，由此能够提高cDNA第二链合成、末端修复和末端加A的效率。此外，在接头连接反应中使用Y字型接头能够提高连接效率，从而有助于提高mRNA文库构建的效率。
[0008]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，在所述第一反应体系中，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0U/μL至1.5U/μL。由此，能够有效提高cDNA第一链合成的效率。
[0009]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，在所述第二反应体系中，所述DNA聚合酶I的工作浓度为0.6U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1U/μL至0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL至0.5U/μL，所述Taq
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B DNA聚合酶的工作浓度为0.04U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08U/μL至0.12U/μL。由此，能够有效提高第二反应体系内的反应效率。
[0010]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，所述第一缓冲液还包括Tris
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HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，在所述第一反应体系中，所述dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris
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HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。在这种情况下，第一缓冲液能够保持第一反应体系的pH以及酶的稳定性。
[0011]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，所述第二缓冲液还包括Tris
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HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；在所述第二反应体系中，所述dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris
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HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。在这种情况下，第二缓冲液能够保持第二反应体系的pH以及酶的稳定性。
[0012]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris
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HCl、镁离子和随机六聚体引物。由此，能够获得合适长度的mRNA片段，并且能够提供后续合成cDNA第一链所需的随机六聚体引物。
[0013]另外，在本公开一方面所涉及的构建mRNA文库的方法中，可选地，所述第三缓冲液还包括ATP，Tris
‑
HCl，氯化镁，二硫苏糖醇和聚乙二醇8000，在所述第三反应体系中，所述T4 DNA连接酶的工作浓度为10U/μL至30U/μL；所述Y字型接头的工作浓度为1
×
10
‑7M至3
×
10...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高建库效率的构建mRNA文库的方法，其特征在于，包括：cDNA第一链合成步骤；cDNA第二链合成、末端修复和末端加A步骤；接头连接步骤以及文库扩增步骤；其中，所述cDNA第一链合成步骤包括对第一反应体系进行第一热处理并获得cDNA第一链，所述第一反应体系包括mRNA片段、核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶、逆转录酶和dNTP；所述cDNA第二链合成、末端修复和末端加A步骤均在第二反应体系中进行，对所述所述第二反应体进行第二热处理并获得cDNA，所述第二反应体系包括所述cDNA第一链、DNA聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq
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B DNA聚合酶、Klenow片段和dNTP，其中所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性；所述接头连接步骤使所述cDNA与Y字型接头连接；所述文库扩增步骤对连接有Y字型接头的cDNA进行PCR扩增，以得到所述mRNA文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括前置步骤，所述前置步骤包括提取mRNA并片段化，以得到所述mRNA片段。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一热处理的程序为：25℃持续10min，42℃持续15min，70℃持续15min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二热处理的程序为：16℃持续30min。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述第二热处理中，以所述cD...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢超，马焕班，吕艳花，
申请(专利权)人：江西海普洛斯医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：