单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，该方法包括：将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核；采用不同的序列标签对多个细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各细胞核内的片段化DNA连接有由多个序列标签组成的标签码，各细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同；及扩增连接有标签码的片段化DNA，得到单细胞基因组测序用的DNA文库。该方法快捷且成本较低。

Construction of DNA library for single cell genome sequencing

【技术实现步骤摘要】
单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法
本专利技术涉及生物技术，特别是涉及一种单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法。
技术介绍
单细胞基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增和测序的一项技术。其原理是将分离的单个细胞的全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，可用于揭示细胞群中个体差异和细胞进化关系。目前，单细胞基因组测序首先需要构建单细胞基因组文库，然后再进行测序分析。然而在构建单细胞基因组文库时，要依赖于昂贵的微流控平台及试剂对单细胞进行分离，此操作较为繁琐、成本较高。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种快捷、成本较低的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法。一种单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，包括：将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核；采用不同的序列标签对多个所述细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各所述细胞核内的片段化DNA连接有由多个所述序列标签组成的标签码，各所述细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同；及扩增所述连接有标签码的片段化DNA，得到单细胞基因组测序用的DNA文库。上述细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法。通过将细胞核作为标记DNA的反应室，采用不同的序列标签对细胞核内的DNA进行多轮标记，最终使得每个细胞核内的DNA都连上一个经多轮标记而形成的独特标签码，以该标签码区分不同的细胞核，从而实现单个细胞的区分。该方法操作简便、且成本较低。附图说明图1为实施例1的单细胞DNA片段分布图；图2为实施例1的细胞区分效率图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的部分实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一实施方式的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，该方法通过将细胞核作为标记DNA的反应场所，采用不同的序列标签对细胞核内的DNA进行多轮标记，最终使得每个细胞核内的DNA都连上一个经多轮标记而形成的独特标签码，以该标签码区分不同的细胞核，从而实现单个细胞的区分。以序列标签种类为96种为例，经过一轮标记之后就形成96种标记，经过两轮标记之后能形成9216种标记，经三轮标记之后就能形成884736种标记。因此，若待区分的细胞个数小于884736，则经过三轮标记就能使得各个细胞核中的DNA连接的标签码各不相同。该方法不必使用微流控技术区分单个细胞，通过多轮DNA标记(DNA连接反应)就能实现单个细胞的区分，操作简便，成本低，是一种快捷且成本较低的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法。具体地，该单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法包括步骤S110～步骤S130。步骤S110：将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核。具体地，收集细胞并计数，然后将细胞的细胞膜裂解，得到细胞核；然后将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核。将细胞核内的DNA片段化便于加上序列标签。在本实施方式中，细胞的计数采用先甲醛固定后计数的方式。具体地，先将收集的细胞与甲醛混合，使得细胞固定以便计数，然后对固定的细胞进行计数。当然，在其他实施方式中，也可以采用其他本领域常用的细胞计数方式进行细胞计数。在本实施方式中，将细胞核内的DNA片段化的方式为酶切。具体地，酶切所用的酶为DpnII。在标记之前将细胞核内的DNA片段化，使得DNA有粘性末端出现，便于序列标签与DNA连接。步骤S120：采用不同的序列标签对多个细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各细胞核内的片段化DNA连接有由多个序列标签组成的标签码，各细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同。具体地，序列标签为碱基序列，用于形成标签码。在测序时，同一个细胞核内的片段化DNA连接的标签码相同，不同细胞核内的片段化DNA连接的标签码不同。通过识别标签码而区分不同的细胞核内的片段化DNA，从而实现单细胞基因组测序。序列标签包括识别部(barcode)，识别部起标识作用。在本实施方式中，序列标签为200种，200种序列标签的识别部的碱基序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.200所示。进一步地，序列标签还包括连接部(linker)，连接部用于序列标签之间的连接。更进一步地，识别部与连接部通过碱基互补配对的方式连接。当然，在其他实施方式中，标签序列不限于200种，可以根据需要区分的细胞的总数及标记的轮数进行选择，例如可以是48种、96种、384种等。序列标签的识别部的碱基序列也不限于上述SEQIDNo.1～SEQIDNo.200所示的碱基序列，可以根据实际需求进行选择，只要能够其识别作用即可。进一步地，采用不同的序列标签对多个细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各细胞核内的片段化DNA连接有由多个序列标签组成的标签码，各细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同的步骤包括步骤S121～步骤S123。步骤S121：将多个DNA被片段化的细胞核分组后，采用不同的第一序列标签对各组细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组细胞核内的片段化DNA均连接上第一序列标签，各组细胞核的片段化DNA连接的第一序列标签各不相同，得到多组一级标记细胞核。其中，第一序列标签包括用于标识的第一序列和用于与第二序列标签连接的第一连接序列。第一序列与第一连接序列、第一连接序列与第二序列标签均通过碱基互补配对的方式连接。进一步地，第一序列的5’端连接有磷酸基团。通过磷酸基团能够使得第一序列与片段化DNA连接。在本实施方式中，第一序列的碱基序列选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.96所示的碱基序列中的一种；第一连接序列的碱基序列如SEQIDNo.201所示。当然，第一序列的碱基序列不限于上述SEQIDNo.1～SEQIDNo.96所示的碱基序列中的一种。在其他实施方式中，还可以是本领域其他常用于起标识作用的碱基序列或根据本领域的常规方法设计的用于起标识作用的碱基序列；同样地，第一连接序列的碱基序列也不限于上述SEQIDNo.201所示的碱基序列。在本实施方式中，多个细胞的细胞核的分组方式为随机均等分组。具体地，将多个DNA被片段化的细胞核分组后与不同的第一序列标签混合，然后孵育，得到多组含有不同第一序列标签的预连接液；及向各组预连接液中加入DNA连接酶，然后孵育，得到多组一级标记细胞核。通过先将第一序列标签与细胞核混合孵育之后，再加入连接酶孵育，使得第一序列标签先进入细胞核内与细胞核内的片段化DNA混合，使得多个片段化DNA被第一序列标签间隔，减少多个片段化DNA间的互联。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，包括：/n步骤S110：将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核；/n步骤S120：采用不同的序列标签对多个所述细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各所述细胞核内的片段化DNA连接有由多个所述序列标签组成的标签码，各所述细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同；及/n步骤S130：扩增所述连接有标签码的片段化DNA，得到单细胞基因组测序用的DNA文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，包括：
步骤S110：将细胞核内的DNA片段化，得到DNA被片段化的细胞核；
步骤S120：采用不同的序列标签对多个所述细胞核内的片段化DNA进行多轮标记，使得各所述细胞核内的片段化DNA连接有由多个所述序列标签组成的标签码，各所述细胞核的片段化DNA连接的标签码各不同；及
步骤S130：扩增所述连接有标签码的片段化DNA，得到单细胞基因组测序用的DNA文库。


2.根据权利要求1所述的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S120包括：
将多个DNA被片段化的细胞核分组后，采用不同的第一序列标签对各组所述细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组所述细胞核内的片段化DNA均连接上第一序列标签，各组所述细胞核的片段化DNA连接的第一序列标签各不相同，得到多组一级标记细胞核；
将多组所述一级标记细胞核混合后分组，然后采用不同的第二序列标签对分组后的所述一级标记细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组所述一级标记细胞核内的片段化DNA均连接上第二序列标签，各组所述一级标记细胞核的片段化DNA连接的第二序列标签各不相同，得到多组二级标记细胞核；及
将多组所述二级标记细胞核混合后分组，然后采用不同的第三序列标签对分组后的所述二级标记细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组所述二级标记细胞核的片段化DNA均连接上所述第三序列标签，各组所述二级标记细胞核的DNA连接的第三序列标签各不相同，得到多组三级标记细胞核，其中，所述第一序列标签的种类数与所述第二序列标签的种类数和所述第三序列标签的种类数之积大于所述DNA被片段化的细胞核的个数。


3.根据权利要求2所述的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，各所述细胞核的片段化DNA的所述标签码由各所述细胞核的片段化DNA对应的所述第一序列标签、所述第二序列标签及所述第三序列标签依次连接而成。


4.根据权利要求2所述的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，所述将多个DNA被片段化的细胞核分组后，采用不同的第一序列标签对各组所述细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组所述细胞核内的片段化DNA均连接上第一序列标签，各组所述细胞核的片段化DNA连接的第一序列标签各不相同，得到多组一级标记细胞核的步骤包括：
将多个DNA被片段化的细胞核分组后与不同的第一序列标签混合，然后孵育，得到多组含有不同第一序列标签的预连接液；及
向各组所述预连接液中加入DNA连接酶，然后孵育，得到多组一级标记细胞核。


5.根据权利要求2所述的单细胞基因组测序用的DNA文库的构建方法，其特征在于，在所述将多个DNA被片段化的细胞核分组后，采用不同的第一序列标签对各组所述细胞核内的片段化DNA进行标记，使得各组所述细胞核内的片段化DNA均连接上第一序列标签，各组所述细胞核的片段化DNA连接的第一序列标签各不相同，得到多组一级标记细胞核的步骤之后，还包括将各组所述一级标记细胞核分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟继先，龙艳萍，肖丽丹，张飞，鹿东东，刘智剑，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东;44