胎儿游离DNA的富集方法技术

本发明专利技术提供了一种胎儿游离DNA的富集方法。该富集方法包括：采用20～33bp的Y型接头与游离DNA进行连接，得到总游离DNA的连接片段；采用磁珠对总游离DNA的连接片段进行纯化并回收50‑150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA。该富集方法针对游离DNA中胎儿游离DNA集中在50‑150bp这一特点，通过对二代测序文库构建过程中的操作步骤进行调整，对接头进行截短，并去除大于150bp的游离DNA片段，富集50‑150bp的游离DNA片段，从而实现对于胎儿游离DNA的富集。

Enrichment of fetal free DNA

【技术实现步骤摘要】
胎儿游离DNA的富集方法
本专利技术涉及产前筛查领域，具体而言，涉及一种胎儿游离DNA的富集方法。
技术介绍
产前筛查对于降低出生缺陷具有重要的意义。它不仅可以筛查21、18和13染色体三体，它还可以对染色体非整倍体(微缺失、微重复)引起的疾病进行筛查。此外，它也有助于单基因病(罕见病)的预防也有重要的意义。提高胎儿游离DNA在总游离DNA中所占比例，对于提高产前筛查的准确性具有重要的意义。现有针对外周血中胎儿游离DNA的富集方法有很多中，总结起来有以下几类：第一类：通过分离有核红细胞实现对胎儿DNA的富集成人的红细胞中无细胞核，不含有DNA。胎儿的红细胞中含有细胞核，存在基因组DNA序列。通过从母体血液中分离有核红细胞，可以实现对胎儿游离DNA的富集。该方法的局限性在于：1.技术要求高；2.样品体积需求较大，孕妇难于接受；3.分离有核红细胞周期长，难于实现自动化；4.成功率低；5.成本高。第二类：通过甲基化实现对cffDNA的富集与成人相比，胎儿游离DNA中含有较多的甲基化修饰。通过对甲基化的DNA的捕获，可以富集胎儿游离DNA。该方法的局限性在于：1.技术繁琐、难度大；2.胎儿游离DNA筛选成本高；3.难于实验自动化。第三类：基于cffDNA大小的筛选方案母亲来源的cfDNA的峰值在160～170bp之间，小于150bp的游离DNA中，胎儿来源的游离DNA所占比例较高。通过对小于150bp游离DNA的筛选，可以提高胎儿游离DNA在总游离DNA中所占的比例，从而实现对胎儿游离DNA的富集。人们通常采用两种方案对较小的游离DNA进行筛选。1.对游离DNA或游离DNA文库进行琼脂糖电泳，之后通过切胶对小于150bp的游离DNA片段进行筛选；2.通过选择性纯化回收磁珠对游离DNA或游离DNA文库进行筛选，去除大于150bp的游离DNA文库，回收较小的游离DNA片段；这类筛选方案的局限性在于：1.通过切胶回收对DNA片段进行筛选回收时，DNA大小判断不准确、技术可重复性差；2.通过选择性纯化回收磁珠对游离DNA或文库进行筛选时，在Illumina测序建库体系中会产生大量的接头二聚体污染，降低测序质量以及reads的有效利用率。目前二代测序领域，illumina测序仪器市场占比大于70％，居于统治地位。基于Illumina测序仪的文库构建时会产生长度为120bp的接头二聚体。在进行胎儿游离DNA富集时需要回收较小的游离DNA片段(50-150bp)，加入120bp的接头后，170bp的文库片段与120bp的接头二聚体难以用选择性纯化磁珠区分，会造成文库中残留大量接头二聚体或小的游离DNA片段，未能得到充分的富集。综上可知，现有的富集方法存在效率低的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种胎儿游离DNA的富集方法，以解决现有技术中胎儿游离DNA富集效率低的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种胎儿游离DNA的富集方法，该富集方法包括：采用20～33bp的Y型接头与游离DNA进行连接，得到总游离DNA的连接片段；采用磁珠对总游离DNA的连接片段进行纯化并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA。进一步地，对总游离DNA的连接片段进行纯化并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA包括：向总游离DNA的连接片段中加入0.8-1.2倍连接片段体积的磁珠去除长度大于150bp的游离DNA对应的连接片段，得到第一纯化片段；向第一纯化片段中加入磁珠及异丙醇，并通过控制两次加入磁珠的总量达到第一纯化片段的体积的1.2-1.8倍，加入的异丙醇的体积为第一纯化片段体积的0.2-2.0倍，优选0.5-0.9倍，从而回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA。进一步地，对连接片段进行纯化，并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA包括：对总游离DNA的连接片段进行全部回收，得到回收产物；对回收产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进行去除，得到第二纯化片段；回收第二纯化片段中50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA。进一步地，对总游离DNA的连接片段进行全部回收，得到回收产物包括：通过向总游离DNA的连接片段中加入1.0-2.0倍，优选1.2-1.8倍总游离DNA的连接片段体积的磁珠和0.2-2.0倍，优选0.5-1.0倍总游离DNA的连接片段体积的异丙醇，从而对总游离DNA的连接片段进行全部回收，得到回收产物。进一步地，对回收产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进行去除，得到第二纯化片段包括：通过向回收产物中加入1.0-1.5倍，优选1.1-1.2倍回收产物体积的磁珠，从而选去除大于150bp的游离DNA对应的连接片段，得到第二纯化片段。进一步地，回收第二纯化片段中50-150bp的游离DNA对应的连接片段，得到富集的胎儿游离DNA包括：向第二纯化片段中再次加入磁珠，并控制磁珠的总体积达到第二纯化片段体积的1.5-2.0倍，优选1.7-1.9倍；之后继续加入0.2-2.0倍，优选0.5-0.9倍第二纯化片段体积的异丙醇，或者0.5-4.0倍第二纯化片段体积的无水乙醇，从而完成对50-150bp的游离DNA对应的连接片段的回收，得到富集的胎儿游离DNA。进一步地，富集方法还包括：对富集的胎儿游离DNA进行PCR扩增构建成胎儿游离DNA文库。进一步地，采用单端带有index的扩增引物，对富集的胎儿游离DNA进行PCR扩增，得到扩增文库；对扩增文库进行纯化回收，得到胎儿游离DNA文库。进一步地，对扩增文库进行纯化回收包括：采用1.0-2.0倍，优选1.7-1.9倍扩增文库体积的磁珠及0.2-2.0倍，优选0.5-0.9倍扩增文库体积的异丙醇对扩增文库进行纯化回收；或者采用1.0-2.0倍，优选1.7-1.9倍扩增文库体积的磁珠及0.5-4.0倍述扩增文库体积的无水乙醇对扩增文库进行纯化回收。进一步地，20～33bp的Y型接头为Illumina测序平台的不含index序列的Y型接头。应用本专利技术的技术方案，该富集方法针对游离DNA中胎儿游离DNA集中在50-150bp这一特点，通过对二代测序文库构建过程中的操作方法进行调整，对接头进行截短，并去除大于150bp的游离DNA片段，富集50-150bp的游离DNA片段，从而实现对于胎儿游离DNA的富集。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了产前诊断过程中采用通用建库方法对胎儿游离DNA进行富集的流程图：图2示出了本申请改进的建库方法对胎儿游离DNA进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胎儿游离DNA的富集方法，其特征在于，所述富集方法包括:/n采用20～33bp的Y型接头与游离DNA进行连接，得到总游离DNA的连接片段；/n采用磁珠对所述总游离DNA的所述连接片段进行纯化并回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种胎儿游离DNA的富集方法，其特征在于，所述富集方法包括:
采用20～33bp的Y型接头与游离DNA进行连接，得到总游离DNA的连接片段；
采用磁珠对所述总游离DNA的所述连接片段进行纯化并回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA。


2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，对所述总游离DNA的所述连接片段进行纯化并回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA包括：
向所述总游离DNA的所述连接片段中加入0.8-1.2倍所述连接片段体积的磁珠去除长度大于150bp的游离DNA对应的所述连接片段，得到第一纯化片段；
向所述第一纯化片段中加入所述磁珠及异丙醇，并通过控制两次加入所述磁珠的总量达到所述第一纯化片段的体积的1.2-1.8倍，加入的所述异丙醇的体积为所述第一纯化片段体积的0.2-2.0倍，优选0.5-0.9倍，从而回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA。


3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，对所述连接片段进行纯化，并回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA包括：
对所述总游离DNA的所述连接片段进行全部回收，得到回收产物；
对所述回收产物中的大于150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段进行去除，得到第二纯化片段；
回收所述第二纯化片段中50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段，得到富集的所述胎儿游离DNA。


4.根据权利要求3所述的富集方法，其特征在于，对所述总游离DNA的所述连接片段进行全部回收，得到所述回收产物包括：
通过向所述总游离DNA的所述连接片段中加入1.0-2.0倍，优选1.2-1.8倍所述总游离DNA的所述连接片段体积的磁珠和0.2-2.0倍，优选0.5-1.0倍所述总游离DNA的所述连接片段体积的异丙醇，从而对所述总游离DNA的所述连接片段进行全部回收，得到所述回收产物。

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【专利技术属性】
技术研发人员：赵军，方楠，林少航，贾晋红，王伟伟，伍启熹，王建伟，刘倩，唐宇，
申请(专利权)人：北京科迅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11