本发明专利技术公开了一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38所示的19组引物对。本发明专利技术还公开了一种方法，包括：1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；2)以总DNA为模板，采用引物对分别进行聚合酶链式反应，获得扩增产物；3)测序获得序列信息。本发明专利技术还公开了该引物组合于科学研究中的应用。本发明专利技术通过提供特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生，可方便快捷、准确地对鲤的线粒体DNA进行扩增并扩增出19个片段，最终拼接完成后可得到鲤鱼的完整线粒体DNA，长度达到16580bp左右。本发明专利技术可为鲤的遗传物质研究提供极大的便利。
Primer combinations for amplification of mitochondrial DNA fragments of carp and their application
【技术实现步骤摘要】
用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用。
技术介绍
鲤鱼(CyprinuscarpioL.)目前有100多个国家和地区养殖，年产量400万吨以上，是最重要的水产养殖种之一。我国是最大的鲤养殖国和消费国，年产量302万吨，占世界总产量的80％。鲤鱼作为一种重要模型物种，也广泛应用于环境毒理学、发育生物学、生理学、免疫学以及进化基因组学等领域的研究。因此，在过去十几年间，大量鲤鱼基因组资源被广泛开发，包括遗传标记、遗传图谱、BAC数据库、ESTs以及转录组序列等。因此用聚合酶链式反应将鲤鱼线粒体DNA序列扩增出来，可以为鲤鱼的遗传和进化研究提供科学依据。现在获取鲤鱼DNA序列的方法主要是引物扩增然后测序，但存在的最大问题就是引物灵敏度和特异性较差，经常出现错配、非特异性扩增或扩增不出条带等现象。因此，这一技术的关键是采用尽可能少的引物组合在适合的条件下扩增，得到完整的线粒体DNA片段。亟需一种简捷方便、灵敏性高、特异性强、结果可靠的扩增方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供了一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合。本专利技术通过设计特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生。本专利技术用尽可能少的引物组合扩增出完整的鲤鱼线粒体DNA片段，为鲤鱼的遗传研究提供方便。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的第一组引物对，如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的第二组引物对，如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的第三组引物对，如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的第四组引物对，如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的第五组引物对，如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的第六组引物对，如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的第七组引物对，如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的第八组引物对，如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的第九组引物对，如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示的第十组引物对，如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示的第十一组引物对，如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示的第十二组引物对，如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示的第十三组引物对，如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示的第十四组引物对，如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的第十五组引物对，如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的第十六组引物对，如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34所示的第十七路组引物对，如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示的第十八组引物对和如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。且如SEQIDNO:38所示的下游引物与线粒体DNA互补的位置处于如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物对与线粒体DNA互补的位置之间。优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，所述19组引物对分别应用于聚合酶链式反应中。优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，聚合酶链式反应中，鲤鱼样本的模板为鲤鱼总DNA。优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，所述鲤鱼样本的品种为福瑞鲤、黄河鲤、锦鲤或荷包红鲤。一种利用所述的引物组合获取到鲤鱼线粒体DNA序列信息的方法，包括如下步骤：1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；2)以步骤1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对进行聚合酶链式反应，获得扩增产物；3)对扩增产物进行测序，之后据所述扩增结果获得序列信息。优选的是，所述的方法，其特征在于，步骤2)中，进行聚合酶链式反应时，50mL反应体系中包含：DNA聚合酶2个单位，10×聚合酶缓冲液5μL，25mmol/L的MgCl25μL，10mmol/L的dNTP1μL，10μmol/L的引物对各2μL，模板DNA100～1000μg。优选的是，所述的方法中，步骤2)中，聚合酶链式反应结束后，将所述扩增产物在666.61-1333.22Pa以下范围的接近真空状态和72℃条件下处理10～20min，然后再至于0～4℃进行保存。优选的是，所述的方法中，步骤1)中，获得待测鲤鱼样本的总DNA的具体方法包括如下步骤：步骤一、剪取鲤鱼的鳍条，保存于无水乙醇中；步骤二、用STE缓冲液将鳍条泡洗5h以上，去除无水乙醇，然后取约0.2g鳍条、剪碎，加入0.5mLSTE缓冲液、10mg/mL的蛋白酶K15和质量体积比10％的SDS40μL于50℃水浴4～6h，最后去除蛋白得到所述总DNA。所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合于科学研究尤其是鲤鱼的遗传物质研究中的应用。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术通过设计出特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生。可方便快捷、结果准确地对鲤鱼的DNA进行扩增并扩增出19种片段，最终长度拼接完成后长度16580左右bp。本专利技术可为鲤鱼的遗传物质研究提供极大的便利。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合的流程示意图；图2为本专利技术其中一个实施例中19对引物的扩增结构示意图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。如图1所示，本专利技术提供一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的第一组引物对，如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的第二组引物对，如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的第三组引物对，如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的第四组引物对，如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的第五组引物对，如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的第六组引物对，如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的第七组引物对，如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的第八组引物对，如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的第九组引物对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一组引物对，如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的第二组引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第三组引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第四组引物对，如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第五组引物对，如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的第六组引物对，如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示的第七组引物对，如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的第八组引物对，如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的第九组引物对，如SEQ ID NO:19和SEQID NO:20所示的第十组引物对，如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的第十一组引物对，如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的第十二组引物对，如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的第十三组引物对，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的第十四组引物对，如SEQID NO:29和SEQ ID NO:30所示的第十五组引物对，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的第十六组引物对，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的第十七路组引物对，如SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36所示的第十八组引物对和如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。/n...
【技术特征摘要】
1.一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的第一组引物对，如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的第二组引物对，如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的第三组引物对，如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的第四组引物对，如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的第五组引物对，如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的第六组引物对，如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的第七组引物对，如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的第八组引物对，如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的第九组引物对，如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示的第十组引物对，如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示的第十一组引物对，如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示的第十二组引物对，如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示的第十三组引物对，如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示的第十四组引物对，如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的第十五组引物对，如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的第十六组引物对，如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34所示的第十七路组引物对，如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示的第十八组引物对和如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。
2.如权利要求1所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，所述19组引物对分别应用于聚合酶链式反应中。
3.如权利要求2所述的用于鲤鱼...
【专利技术属性】
技术研发人员：董传举，姜洲，张猛，王良炎，李学军，孔胜楠，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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