一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法技术

本申请属于生物检测技术领域，公开了一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法。在临床全血样本核酸检测过程中，采用本发明专利技术所述核酸检测全血样本预处理试剂能够有效去除全血样本中的红细胞，消除对PCR扩增的抑制作用。采用本发明专利技术所述核酸检测全血样本预处理方法能够提高样本核酸的提取纯度和效率，可以配合磁珠法核酸提取试剂和荧光PCR扩增检测技术，检测全血样本中的病毒/人基因组核酸。在常规全血样本前处理过程中，使本发明专利技术所述核酸检测全血样本预处理试剂及方法对于临床全血样本检测病毒核酸具有较高的实用价值，适于推广应用。

A pretreatment reagent and method for nucleic acid detection of whole blood sample

【技术实现步骤摘要】
一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法。
技术介绍
血液的主要成分为血浆、血细胞和遗传物质，血液含有各种营养成分，如无机盐、氧、以及细胞代谢产物、激素、酶和抗体等，有营养组织、调节机体器官活动和防御有害物质的作用，因此血液储存着人体健康的各类信息，很多疾病的检测都需要血液指标分析。红细胞也称红血球，是血液中数量最多的一种血细胞，也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。哺乳动物成熟的红细胞是无核的，这意味着它们失去了DNA。红细胞也没有线粒体，它们通过分解葡萄糖释放能量。运输氧气，也运输一部分二氧化碳。运输二氧化碳时呈暗紫色，运输氧气时呈鲜红色。但在利用现代临床诊断方法时红细胞对许多诊断检测都存在干扰，特别是对PCR扩增的抑制影响，假阴性率比较高，因此需要对血液样本进行预处理，把它从血液中分离出去，再进一步对样品进行检测。目前去除红细胞的方法主要有：密度梯度离心法、渗透压差法、自然沉降法、氯化铵分离法等。使用红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用红细胞裂解液改变红细胞的渗透压，造成红细胞胀大破裂，而白细胞因其细胞膜的离子转运通道不同而不受影响，从而达到既不损伤白细胞又能充分的去除红细胞，并能分离富集血液中的白细胞的作用。经红细胞裂解液裂解得到的白细胞中不含红细胞，可进一步用于核酸的分离和提取等。但目前很多常规的红细胞裂解液它们在实际应用中都存在着诸多的问题，如样本处理耗时长、处理程序繁杂、裂解效率不够高、分离细胞纯度不高等。同时沉淀得到的白细胞由于含量较多，在后续核酸纯化过程中往往存在较多杂质蛋白，影响后续纯化过程中核酸的纯度，从而降低了临床样本检测的灵敏度和特异性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的全血样本中红细胞对后续PCR扩增的抑制及灵敏度不高问题，提供一种操作简便核酸检测全血样本预处理试剂及方法，以去除全血样本中的红细胞，消除对PCR扩增的抑制作用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种核酸检测全血样本的预处理试剂，由红细胞裂解液和全血沉淀悬浮液组成；所述红细胞裂解液包含以下组分：10mMNaCl、250mM葡萄糖、0.2％-10％(v/v)NP40、0.01M-0.05M三羟甲基氨基甲烷；所述全血沉淀悬浮液包含以下组分：0.3g/ml-0.7g/ml胍盐、2.5％-20％(v/v)表面活性剂。NP40为乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)，是一种温和的非离子型去垢剂。在一些实施方案中，所述红细胞裂解液中NP40的浓度为6％(v/v)。三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane，THAM)，英文别名：Trisbase，为常用生物缓冲剂。在一些实施方案中，所述红细胞裂解液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.05M。在一些实施方案中，所述的预处理试剂中所述红细胞裂解液包含10mMNaCl、250mM葡萄糖、6％(v/v)NP40、0.05M三羟甲基氨基甲烷，余量为水。本专利技术所述全血沉淀悬浮液中所述的胍盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、碳酸胍中至少一种。本专利技术所述全血沉淀悬浮液中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。包括但不限于烷基醇酰胺、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚。在一些实施方案中，所述全血沉淀悬浮液包含0.4g/ml盐酸胍、14％(v/v)脂肪醇聚氧乙烯醚，余量为水。进一步的，本专利技术所述全血沉淀悬浮液采用Tris调pH至4.1。本专利技术还提供了一种核酸检测全血样本的预处理方法，利用上述核酸检测全血样本的预处理试剂对全血样本进行预处理，具体包括如下步骤：1)取全血样本加入所述预处理试剂中的红细胞裂解液，涡旋振荡混匀裂解得到澄清透明的溶液，离心，弃上清，取沉淀；2)加入所述预处理试剂中的全血沉淀悬浮液，充分涡旋重悬沉淀，瞬时离心，孵育后涡旋振荡，备用。本专利技术所述核酸检测全血样本的预处理方法使用所述预处理试剂中的红细胞裂解液使细胞膜胀破，通过离心弃上清去除红细胞留沉淀。进一步通过所述预处理试剂中的全血沉淀悬浮液将沉淀中白细胞进行预纯化裂解，将杂质蛋白进行预处理，提高后续核酸纯化的纯度。在预裂解处理白细胞的同时，也能够释放核酸，增加核酸释放的能力，提高临床样本检测的灵敏度和特异性。在本专利技术中，所述全血样本与所述红细胞裂解液的体积比为1：(3-6)，所述全血样本与所述全血沉淀悬浮液的体积比为1：(2-4)。在一些实施方案中，所述全血样本的用量为0.2-0.4mL，所述红细胞裂解液的用量为1.2mL，所述全血沉淀悬浮液的用量为0.8mL。在本专利技术中，步骤1)中所述裂解时间≥1min。在一些实施方案中，所述预处理方法中，步骤1)中所述离心为12000rpm/min，离心2min。在本专利技术中，步骤2)中孵育为90℃，孵育5min.在一些实施方案中，所述预处理方法中，步骤2)中孵育后涡旋振荡5s。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法。在临床全血样本核酸检测过程中，采用本专利技术所述核酸检测全血样本预处理试剂能够有效去除全血样本中的红细胞，消除对PCR扩增的抑制作用。采用本专利技术所述核酸检测全血样本预处理方法能够提高样本核酸的提取纯度和效率，可以配合磁珠法核酸提取试剂和荧光PCR扩增检测技术，检测全血样本中的病毒/人基因组核酸。在常规全血样本前处理过程中，使本专利技术所述核酸检测全血样本预处理试剂及方法对于临床全血样本检测病毒核酸具有较高的实用价值，适于推广应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1中两种全血前处理方法处理的样本经核酸提取、扩增检测后的结果比较图；其中的专利技术方法为采用本专利技术所述前处理方法处理的样本核酸提取、扩增检测后的结果，传统方法为采用普通全血前处理方法(直接离心法)处理的样本核酸提取、扩增检测后的结果；图2示实施例2中两种全血前处理方法处理的EBV中阳样本经核酸提取、扩增检测后的结果比较图；图3示实施例2中两种全血前处理方法处理的EBV中弱样本经核酸提取、扩增检测后的结果比较图；图4示实施例3本专利技术所述全血前处理方法处理的EBV检测限样本经核酸提取、扩增检测后的灵敏度检出图。具体实施方式本专利技术公开了一种核酸检测全血样本预处理试剂及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸检测全血样本的预处理试剂，由红细胞裂解液和全血沉淀悬浮液组成；/n所述红细胞裂解液包含以下组分：10mM NaCl、250mM葡萄糖、0.2％-10％(v/v)NP40、0.01M-0.05M三羟甲基氨基甲烷；/n所述全血沉淀悬浮液包含以下组分：0.3g/ml-0.7g/ml胍盐、2.5％-20％(v/v)表面活性剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测全血样本的预处理试剂，由红细胞裂解液和全血沉淀悬浮液组成；
所述红细胞裂解液包含以下组分：10mMNaCl、250mM葡萄糖、0.2％-10％(v/v)NP40、0.01M-0.05M三羟甲基氨基甲烷；
所述全血沉淀悬浮液包含以下组分：0.3g/ml-0.7g/ml胍盐、2.5％-20％(v/v)表面活性剂。


2.根据权利要求1所述的预处理试剂，所述红细胞裂解液包含5mMNaCl、320mM葡萄糖、6％(v/v)NP40、0.05M三羟甲基氨基甲烷，余量为水。


3.根据权利要求1所述的预处理试剂，所述全血沉淀悬浮液中所述的胍盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、碳酸胍中至少一种；所述表面活性剂为非离子表面活性剂。


4.根据权利要求1所述的预处理试剂，所述全血沉淀悬浮液包含0.4g/ml盐酸胍、14％脂肪醇聚氧乙烯醚，余量为水。


5.一种核酸检测全血样本的预处理方法，利用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学增，王玮，李振红，杜美，鲁清月，付光宇，吴学炜，苗拥军，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41