【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物检测与生物信息学，具体涉及一种针对复杂基因组的引物设计方法，以及采用该方法设计得到的病原微生物检测用引物组及检测试剂盒。
技术介绍
1、病原微生物是指可以侵犯人体，在宿主中生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度病理变化、发生感染的微生物，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体等。病原微生物检测在感染判定中意义重大，除了传统的检测方法如涂片染色、培养分离、免疫学检测、核酸检测外，还有新兴的基因芯片、二代测序技术(如mngs)等。
2、二代测序(ngs)也称为高通量测序或大规模平行测序，可一次对数千到数十亿个dna片段进行独立的序列测定。mngs(宏基因组高通量测序)是以ngs为基础，对样本中所有微生物的dna片段进行高通量测序的技术，测序后通过与特定的数据库进行比对分析，就能无偏倚的在同一样本中检测多种病原微生物。tngs(靶向基因测序)又称为病原体靶向测序，是基于靶向捕获或超多重pcr、联合高通量测序技术开发的快速、低成本检测技术。tngs不依赖于传统的微生物培养，可以直接对临床样本中的核酸进行富集，之后通过高通量测序和数据库比对分析判断样本中病原微生物的种类、毒力以及耐药基因，为临床诊断提供依据。尤其是tngs中的pcr扩增子富集测序，将pcr与ngs的优势相结合，采用超多重pcr正向富集目标病原体的核酸，在提升检测灵敏度的同时排除了宿主核酸的干扰，经测序和生信分析可以实现不同症候群、感染脏器、患者类型等临床场景的核心病原鉴定。相较mngs，tngs极大提高了检测敏感性，缩短了检测时
3、众所周知，基于tngs进行物种鉴定需要针对物种的特异性序列设计引物，而用于物种鉴定的pcr引物的设计关键在于：既要找到物种的特异性序列，又要求该序列能够尽可能覆盖物种内的所有微生物，二者之间存在一定的关联与冲突。目前，针对物种鉴定的特异性序列的筛选与pcr引物的设计主要依赖于经验和文献检索。例如，中国专利申请cn116287357a(北京百奥益康)公开的一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测引物组及试剂盒，包含金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌和化脓性链球菌的特异性扩增引物。然而，上述5种病原微生物虽在临床检验中较为常见，但可检测的呼吸道病原的种类仍较少。而常见的呼吸道病原除包括细菌外，还包括病毒、真菌、衣原体、支原体、立克次体等类型。然而，现有的针对多种病原体检测的特异性序列的筛选与引物设计方法多存在效率低、试错成本高、分类特异性差、物种覆盖度低等问题。为此，中国专利申请cn115719616a(先声医学诊断)提供了一种病原物种特异性序列筛选的方法，包括：(1)基于公共数据库(如refseq、genbank)进行病原物种序列的筛选和过滤，构建病原比对数据库；(2)从病原比对数据库中筛选高质量目标物种的基因组序列，如完整的基因组序列或染色体级别基因组序列；(3)对筛选出的基因组序列进行打断处理，合并所有打断的序列片段进行聚类；(4)基于聚类结果，从每个聚类cluster中随机挑选1条序列作为代表序列，将代表序列与病原比对数据库进行比对，将序列相似度m高于阈值、且除比对到目标物种外未比对到其他物种的代表序列作为该物种的特异性序列。该方法适用于多种病原体的特异性序列的筛选，具有准确性高、时间成本低等优点，且可用于亚种的分型。但是，该方法依赖于数据库中完整的基因组序列或染色体级别的基因组序列，对于复杂基因组的病原微生物无法实现特异性序列的筛选及引物设计，并且该方法采用正向思路，先筛选物种共有保守序列，再确定种间特异性序列，计算过程复杂且耗时。
4、因此，亟待开发一种针对复杂基因组的物种特异性序列筛选及引物设计方法。
技术实现思路
1、本专利技术主要解决的技术问题是提供一种针对复杂基因组的引物设计方法，该方法可不依赖核糖体rna区域短时间内获得目标物种的引物序列，具有设计原理简单、计算简便、对物种复杂度要求低、临床可实施性好、稳定性高等特点，所得引物的检测结果准确可靠，相较传统16s rdna、18s rdna、its区域的鉴别效果更好。
2、其次，本专利技术提供一种病原微生物检测用引物组。
3、再次，本专利技术提供一种病原微生物检测试剂盒。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
5、一种针对复杂基因组的引物设计方法，包括：
6、(1)获取目标物种及其同属其他物种的复杂基因组序列；
7、(2)将每个物种的复杂基因组序列按照contigs的长度进行排序，选取最长的数条contigs连接成一条长序列作为该物种的代表序列；
8、(3)将目标物种及其同属其他物种的代表序列进行多序列比对，选取目标物种独有而同属其他物种没有的区域作为目标物种的特异性序列；
9、(4)针对目标物种的特异性序列设计引物，即得。
10、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述数条contigs至少为5条，可以为5、6、7、8、9、10条序列。
11、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述数条contigs在连接成一条长序列时，在contigs之间添加若干个连续的n作为边界信号。例如，采用5个连续的n以物理隔离不同的contigs。
12、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述多序列比对采用多序列比对软件，以同属所有物种的代表序列作为输入文件。例如，采用progressivemauve软件及默认参数进行共线性比对。
13、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述设计引物采用引物设计软件，以目标物种的特异性序列作为模板，设置包括gc含量、tm值、引物长度、产物长度、返回引物数量在内的多个参数。例如，采用primer3软件，设置gc含量为40％-60％，tm值为57-65℃，引物长度为17-27bp，产物长度为100-120bp，返回引物数量为3-10对。
14、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(4)中，若最终没有返回合适的引物，则说明目标物种的特异性序列选取不当，返回步骤(2)重新选取contigs，连接后得到新的代表序列，再重新执行步骤(3)、步骤(4)的操作。例如，第一次选取最长的10条contigs进行连接，若没有返回合适的引物，第二次则选取最长的20条contigs进行连接，得到新的代表序列后，再次执行步骤(3)的操作，得到新的目标物种的特异性序列，之后再次执行步骤(4)的操作，针对新的目标物种的特异性序列设计得到新的引物。
15、作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述设计引物后对引物进行评估，包括但不限于引物特异性评估、物种覆盖度评估。
16、具体的，所述引物特异性评估是将引物比对回核酸数据库(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对复杂基因组的引物设计方法，其特征在于：所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(2)中，所述数条contigs至少为5条。
3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(2)中，所述数条contigs在连接成一条长序列时，在contigs之间添加若干个连续的N作为边界信号。
4.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(4)中，所述设计引物采用引物设计软件，以目标物种的特异性序列作为模板，设置的参数包括但不限于GC含量、Tm值、引物长度、产物长度、返回引物数量；
5.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(4)中，所述设计引物后对引物进行评估，包括但不限于引物特异性评估、物种覆盖度评估；
6.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(4)中，所述对引物进行评估后，当待检测病原微生物有多种、所用引物经组合后构成一个引物组时，再对引物组进行评估，包括但不限于引物二聚体评估、非特异性扩增产物评估；
7.一种病原微生物检测用引物组，其
8.根据权利要求7所述的引物组，其特征在于：所述引物组包含以下任意一对或多对扩增引物：
9.一种包含如权利要求7-8中任一项所述的引物组的病原微生物检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含聚合酶、扩增反应缓冲液、接头、连接酶、连接反应缓冲液、测序靶标扩增引物、高保真扩增酶、高保真扩增反应缓冲液中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种针对复杂基因组的引物设计方法，其特征在于：所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(2)中，所述数条contigs至少为5条。
3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(2)中，所述数条contigs在连接成一条长序列时，在contigs之间添加若干个连续的n作为边界信号。
4.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(4)中，所述设计引物采用引物设计软件，以目标物种的特异性序列作为模板，设置的参数包括但不限于gc含量、tm值、引物长度、产物长度、返回引物数量；
5.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：步骤(4)中，所述设计引物后对引物进行评估，包括但不限于引物特异性评估、物种覆盖度评估；
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢将，舒静超，董超，张银，张晓亮，张瑞峰，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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