【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，涉及一种核酸绝对定量检测体系及核酸绝对定量方法。
技术介绍
1、核酸包括dna和rna，编码遗传信息，充当允许遗传物质在生物世代之间传递的存储介质。核酸扩增和定量一直是分子生物学领域的核心技术之一，已应用到分子测序、基因表达分析、基因突变研究、疾病早期分子诊断、单核苷酸多态性和药物筛选等研究领域，并起到重要作用。。
2、目前，应用最多的核酸定量技术是实时荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)。这种方法在检测时根据加入的荧光分子探针信号实时观察模板的扩增情况，检测结果以线性的扩增信号形式输出，根据已知标准样品的扩增曲线来推算未知样品的起始模板拷贝量。因而qpcr技术是一种相对的核算定量方法，其灵敏度和准确性均受到限制。近年来，数字聚合酶链式反应(dpcr)技术发展迅速，该技术通过将单个核酸分子分隔在单个隔室中进行pcr反应以鉴定目标分子的存在。目前dpcr技术主要有微流控芯片阵列反应室或液滴数字分析技术和乳液微滴数字分析技术两种。基于微流控装置及芯片的dpcr技术的可扩展性有限、检测通量低。乳液微滴数字分析技术采用乳液密封磁珠的方法，提供了一种更高通量的dpcr技术，然而，该技术仍存在不少缺陷，比如模板和磁珠没有被分隔在同一个液滴中时，会导致检测不到目标模板、dna提取物中的聚合酶抑制剂会影响扩增反应的效率以及工作流程和热循环扩增的复杂性。
3、综上所述，如何提供一种具有高通量、技术稳定、操作简单的核酸绝对定量方法，是目前分子生物学领域亟需解决问题之一。
技
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种核酸绝对定量检测体系及核酸绝对定量方法，本专利技术设计全新核酸绝对定量检测体系，可快速、准确实现无需做标准曲线的核酸绝对定量，操作简单、成本低。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种核酸绝对定量检测体系，所述核酸绝对定量检测体系含有：四臂聚乙二醇丙烯酸酯、双巯基聚乙二醇、靶标核酸分子的引物和核酸扩增反应的试剂，所述核酸绝对定量检测体系中所述四臂聚乙二醇丙烯酸酯和双巯基聚乙二醇的质量比为(1～2):1，包括但不限于1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、16:11、1.5:1、1.7:1、1.8:1或2:1，优选为16:11。
4、本专利技术设计核酸绝对定量检测体系，利用四臂聚乙二醇丙烯酸酯(4arm-peg-ac)和双巯基聚乙二醇(sh-peg-sh)两种单体组合成胶的水凝胶体系，在常温下即可自发的聚合成胶，无需引发，避免对核酸扩增反应体系造成影响，此外，通过控制二者质量比，进一步提高核酸扩增的速度和效率并改善荧光扩散情况，以实现快速准确定量检测。
5、优选地，所述四臂聚乙二醇丙烯酸酯的重均分子量(mw)为5000～20000，包括但不限于5100、5500、6000、8000、10000、12000、15000、18000或19000。
6、优选地，所述双巯基聚乙二醇的重均分子量为1000～10000，包括但不限于1200、1500、1600、2000、3000、5000、6000、8000或9000。
7、本专利技术中，控制检测体系中四臂聚乙二醇丙烯酸酯和双巯基聚乙二醇的重均分子量，能够进一步控制荧光亮点的形状、大小，以进一步便于检测分析。
8、优选地，所述核酸绝对定量检测体系中所述四臂聚乙二醇丙烯酸酯的重均分子量为10000和双巯基聚乙二醇的重均分子量为3400。
9、优选地，所述靶标核酸分子包括大肠杆菌23s核糖体基因、细胞角蛋白19基因或hpv基因中任意一种或至少两种的组合。
10、可以理解，本领域通用核酸扩增方法均适用于本专利技术。
11、优选地，所述核酸扩增反应可包括环介导等温扩增反应(lamp)、重组酶聚合酶扩增反应(rpa)、聚合酶链式扩增反应(pcr)或滚环扩增反应(rca)中的任意一种。
12、可以理解，本领域通用核酸扩增反应的试剂均适用于本专利技术，如lamp反应试剂warmstart lamp 2×master mix(biolabs)和lamp fluorescent dye(biolabs)。
13、可以理解，根据不同靶标核酸分子设计引物，可实现对任意靶标核酸分子检测。
14、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的正向外引物的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。
15、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的正向内引物的核酸序列包括seq id no.2所示的序列。
16、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的反向外引物的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。
17、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的反向内引物的核酸序列包括seq id no.4所示的序列。
18、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的正向环导引物的核酸序列包括seq idno.5所示的序列。
19、优选地，所述大肠杆菌23s核糖体基因的反向环导引物的核酸序列包括seq idno.6所示的序列。
20、seq id no.1(f3)：5’-ggcgttaagttgcagggtat-3’。
21、seq id no.2(fip)：
22、5’-cggttcggtcctccagttagtgttttcccgaaacccggtgatct-3’。
23、seq id no.3(b3)：5’-tcacgaggcgctacctaa-3’。
24、seq id no.4(bip)：
25、5’-tagcggatgacttgtggctggtttttcggggagaaccagctatc-3’。
26、seq id no.5(loopf)：5’-accttcaacctgcccatg-3’。
27、seq id no.6(loopb)：5’-gtgaaaggccaatcaaacc-3’。
28、优选地，所述细胞角蛋白19基因的引物的核酸序列包括seq id no.7所示的序列。
29、seq id no.7(primer)：cctgttccgttcttccttca。
30、优选地，所述hpv基因的正向引物的核酸序列包括seq id no.8所示的序列。
31、优选地，所述hpv基因的反向引物的核酸序列包括seq id no.9所示的序列。
32、seq id no.8(fp)：5’-ctctttggctgcctagtgag-3’。
33、seq id no.9(rp)：5’-gcgtgcaacatattcatccg-3’。
34、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的核酸绝对定量检测体系在制备核酸绝对定量试剂盒中的应用。
35、第三方面，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述核酸绝对定量检测体系含有：四臂聚乙二醇丙烯酸酯、双巯基聚乙二醇、靶标核酸分子的引物和核酸扩增反应的试剂；
2.根据权利要求1所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述四臂聚乙二醇丙烯酸酯的重均分子量为5000～20000；
3.根据权利要求1或2所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子包括大肠杆菌23S核糖体基因、细胞角蛋白19基因或HPV基因中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述核酸扩增反应包括环介导等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应、聚合酶链式扩增反应或滚环扩增反应中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述大肠杆菌23S核糖体基因的正向外引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
6.根据权利要求3所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述细胞角蛋白19基因的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
7.根据权利要求3所
8.权利要求1-7任一项所述的核酸绝对定量检测体系在制备核酸绝对定量试剂盒中的应用。
9.一种核酸绝对定量方法，其特征在于，所述核酸绝对定量方法包括：
10.根据权利要求9所述的核酸绝对定量方法，其特征在于，所述核酸扩增反应包括环介导等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应、聚合酶链式扩增反应或滚环扩增反应中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述核酸绝对定量检测体系含有：四臂聚乙二醇丙烯酸酯、双巯基聚乙二醇、靶标核酸分子的引物和核酸扩增反应的试剂；
2.根据权利要求1所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述四臂聚乙二醇丙烯酸酯的重均分子量为5000～20000；
3.根据权利要求1或2所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子包括大肠杆菌23s核糖体基因、细胞角蛋白19基因或hpv基因中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述核酸扩增反应包括环介导等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应、聚合酶链式扩增反应或滚环扩增反应中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的核酸绝对定量检测体系，其特征在于，所述大...
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