一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法技术

本发明专利技术属于医学检测领域，具体涉及一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法。本发明专利技术利用类似5’RACE的SMART技术和特异性引物，可特异性捕获并无偏好扩增人源RNA中所有低丰度TCRα、TCRβ、BCR重链H、BCR轻链L、BCR轻链K的整个CDR区域(可以单独捕获扩增其中一项，也可以同时捕获扩增所有项目)，并采取一种简单高效的方式对其进行高通量测序文库的构建，从而进行TCR和BCR免疫组库分析。

A high throughput sequencing library construction method for single molecule tag immunoassay Library

【技术实现步骤摘要】
一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法
本专利技术属于医学检测领域，具体涉及一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法。
技术介绍
免疫组库是指在任意指定时间点、个体内所有特异性不同的T淋巴细胞和B淋巴细胞克隆的总和。免疫组库测序是运用高通量测序技术来研究TCR或BCR编码基因多样性的一项技术，通过该技术可以反应T/B细胞克隆变化与疾病的关系，此方法目前在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及移植等多个领域得到广泛应用。DNA和RNA均可成为免疫组库的研究对象。但是，以DNA作为免疫组库测序模板有以下缺点：①扩增过程使用大量的引物对，但是引物之间不可能完美地匹配扩增，易产生非真实性的重组序列；②J-C区之间存在大量内含子使其下游引物必须位于J区；③引物设计来自已知的参考序列，无法捕获未知的序列。使用RNA作为模板建库，下游引物可以选自C区，具有高度的敏感性，而且使用一对引物即可从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’末端，可最大限度避免PCR扩增偏好性，并且可以捕获未知的转录本。但是其也具有不可忽视的缺陷，例如，采用RACE方法进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)提取样本总RNA；/n(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，先后加入RT1引物、单分子标签进行逆转录和模板转换反应，得到带单分子标签的cDNA；/n(3)以一链合成物为模板，加入TS-index引物和RT2引物，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域，并添加测序接头，得到带单分子标签的DNA；/n(4)将特异性扩增产物分选纯化后，加入P7接头引物、P5接头引物，进行PCR扩增，得到测序文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，先后加入RT1引物、单分子标签进行逆转录和模板转换反应，得到带单分子标签的cDNA；
(3)以一链合成物为模板，加入TS-index引物和RT2引物，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域，并添加测序接头，得到带单分子标签的DNA；
(4)将特异性扩增产物分选纯化后，加入P7接头引物、P5接头引物，进行PCR扩增，得到测序文库。


2.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的单分子标签的序列如SQEIDNO.1所示。


3.根据权利要求2所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述单分子标签的3’末端还连接有多个简并碱基，所述简并碱基的个数为1-20个。


4.根据权利要求3所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述简并碱基为原始碱基和/或修饰碱基，所述修饰碱基包括硫代修饰、甲基化修饰、LNA修饰和/或次黄嘌呤修饰。


5.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RT1引物包括如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、和/或SEQIDNO.10所示的序列。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠巍，徐根明，潘艺，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43