麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用，属分子生物学领域。本发明专利技术以不同温度处理的麦长管蚜为实验材料进行荧光定量PCR研究，各候选内参基因定量PCR数据输入RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因‑NADH。在此基础上，发明专利技术人以高温胁迫后的麦长管蚜为样本，以麦长管蚜热激蛋白hsp90为目的基因，筛选出的NADH基因为内参基因，研究了在高温胁迫下的麦长管蚜hsp90基因的表达规律。

Screening method and application of the stable expression of the internal reference gene of Aphis longipectus at different temperatures

【技术实现步骤摘要】
麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用。
技术介绍
麦长管蚜(SitobionavenaeFabricius)属同翅目，蚜科，是我国麦类作物的主要害虫之一，其寄主种类较多，除为害小麦、大麦、燕麦等麦类作物外，也为害水稻、高粱、玉米、甘蔗等其他禾本科作物以及早熟禾、看麦娘、马唐、棒头草、狗尾草、白羊草等禾本科、莎草科杂草。具有分布广、数量大、繁殖力强的特点，影响小麦植株的正常生长，导致小麦产量严重下降，给农业生产造成巨大损失。一般年份可使小麦减产5.1％～16.5％，大发生年份小麦减产40％以上。一般蚜虫都是无翅的，可受外界环境条件和生物因素调节生成有翅蚜和无翅蚜，有翅型个体可远距离迁飞寻找寄主植物，除直接刺吸小麦汁液外，还是传播麦类病毒病的重要媒介。麦长管蚜无翅孤雌蚜体长3.1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至橙红色，头部略显灰色，腹侧具灰绿色斑。触角、喙端节、跗节、腹管黑色，尾片色浅。腹部第六至八节及腹面具横网纹，无缘瘤。中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于：以20℃饲养的麦长管蚜为对照，设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，处理后立刻提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR验证，采用RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于：以20℃饲养的麦长管蚜为对照，设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，处理后立刻提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR验证，采用RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因。


2.根据权利要求1所述的不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）麦长管蚜饲养：麦长管蚜为实验室饲养种群，饲养与人工气候箱中，饲养条件是20±2℃，湿度60-80%，光照为16h光照：8h黑暗；
（2）设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，分别是18℃、24℃和30℃；
（3）设计基因的荧光定量引物：从GneBanck数据和麦长管蚜转录组中获得麦长管蚜ACT、RpS27S、v-ATPase、NADH、18S和EF1a候选内参基因和热激蛋白HSP90的核酸部分序列，利用UNAFold在线软件分析各基因核酸部分序列的二级结构，软件设置如下：meltingtemperature，60℃；DNAsequence，linear；Na+concentration，50mM；Mg2+concentration，3mM；其它选项为初始设置；获得各基因模板序列含有茎环结构的位点后，利用NCBI-Primer-BLAST在线软件设计引物，软件设置如下：primermeltingtemperature，57-63℃；primerGCcontent，40-60%；PCRproductsize，150-300basepairs；Excludedregions，茎环结构位点；其它选项为初始设置；设计获得各基因的特异性实时荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性及按5倍稀释cDNA分别进行定PCR建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；
（4）分别选取18℃、24℃和30℃处理麦长管蚜2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱勋，阎维巍，李祥瑞，张云慧，程登发，李新安，龚培盼，任智萌，王超，魏长平，杨超霞，李亚萍，殷新田，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11