麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用，属分子生物学领域。本发明专利技术以不同温度处理的麦长管蚜为实验材料进行荧光定量PCR研究，各候选内参基因定量PCR数据输入RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因‑NADH。在此基础上，发明专利技术人以高温胁迫后的麦长管蚜为样本，以麦长管蚜热激蛋白hsp90为目的基因，筛选出的NADH基因为内参基因，研究了在高温胁迫下的麦长管蚜hsp90基因的表达规律。

Screening method and application of the stable expression of the internal reference gene of Aphis longipectus at different temperatures

【技术实现步骤摘要】
麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用。
技术介绍
麦长管蚜(SitobionavenaeFabricius)属同翅目，蚜科，是我国麦类作物的主要害虫之一，其寄主种类较多，除为害小麦、大麦、燕麦等麦类作物外，也为害水稻、高粱、玉米、甘蔗等其他禾本科作物以及早熟禾、看麦娘、马唐、棒头草、狗尾草、白羊草等禾本科、莎草科杂草。具有分布广、数量大、繁殖力强的特点，影响小麦植株的正常生长，导致小麦产量严重下降，给农业生产造成巨大损失。一般年份可使小麦减产5.1％～16.5％，大发生年份小麦减产40％以上。一般蚜虫都是无翅的，可受外界环境条件和生物因素调节生成有翅蚜和无翅蚜，有翅型个体可远距离迁飞寻找寄主植物，除直接刺吸小麦汁液外，还是传播麦类病毒病的重要媒介。麦长管蚜无翅孤雌蚜体长3.1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至橙红色，头部略显灰色，腹侧具灰绿色斑。触角、喙端节、跗节、腹管黑色，尾片色浅。腹部第六至八节及腹面具横网纹，无缘瘤。中胸腹岔短柄。额瘤显著外倾。触角细长，全长不及体长，第三节基部具1～4个次生感觉圈。喙粗大，超过中足基节，端节圆锥形，是基宽的1.8倍。腹管长圆筒形，长为体长的1/4，在端部有十几行网纹。尾片长圆锥形，长为腹管的1/2，有6～8根曲毛。有翅孤雌蚜体长3.0mm，椭圆形，绿色，触角黑色，第三节有8～12个感觉圈排成1行。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑色，端部具15～16行横行网纹。前翅中脉三叉，分叉大。在昆虫基因转录水平的研究中，实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)是一种检测特定基因mRNA表达水平和转录分析的有效手段。qRT-PCR技术具有实时检测、特异性强、快速灵敏、准确定量的优点，实现了传统PCR从定性到精准定量的飞跃。进行qRT-PCR试验时，内参基因必须在给定的实验条件下稳定表达。为促进基因表达研究，获得更准确的表达量数据，筛选相对稳定的内参基因是必要的基础工作。理想的内参基因要求不受外界任何环境因素影响，在不同实验条件下均能稳定表达。但是，大量研究表明，不存在绝对稳定表达的基因(Xun,Zetal.,.SelectionandEvaluationofReferenceGenesforExpressionAnalysisUsingqRT-PCRintheBeetArmywormSpo-dopteraexigua(Lepidoptera:Noctuidae)PLoSONE,2014,9(1):e84730.doi:10.1371/journal.pone.0084730.；Shakeel,M.,etal.,Geneexpressionstudiesofreferencegenesforquantitativereal-timePCR:anoverviewininsects.BiotechnologyLetters,2017.40(2):p.227-236.)。目前，常用的昆虫内参基因有：18S核糖体RNA(18SribosomalRNA，18SrRNA)、延伸因子1(Elongationfactor-1alpha，EF1-a)、β-肌动蛋白基因(Betaactin，β-actin)、β-微管蛋白(Betatubulin)、琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(SuccinatedehydrogenasecomplexsubunitA，SDHA)核糖体蛋白S27RibosomalproteinS27(rsp27)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和TATA盒结合蛋白(TATA-Boxbindingprotein)等(Xun,Zetal.,.SelectionandEvaluationofReferenceGenesforExpressionAnalysisUsingqRT-PCRintheBeetArmywormSpo-dopteraexigua(Lepidoptera:Noctuidae)PLoSONE,2014,9(1):e84730.doi:10.1371/journal.pone.0084730.；Shakeel,M.,etal.,Geneexpressionstudiesofreferencegenesforquantitativereal-timePCR:anoverviewininsects.BiotechnologyLetters,2017.40(2):p.227-236.)这些基因在细胞中参与正常的生命代谢。在昆虫样本体内，同一基因在不同种类昆虫中的功能、表达水平存在差异。同样，候选内参基因的表达情况也会因为不同昆虫物种或不同实验条件而存在差异。随着qRT-PCR技术的广泛应用，研究发现，昆虫样品种类和实验条件的不同，持家基因的表达量在某些特定条件下会发生较大的变化，如果盲目地借鉴，可能影响最终定量结果的准确性。NADH-Q还原酶又称为NADH脱氢酶(NADHdehydrogenase)，简称复合体Ⅰ(complexⅠ)，是一个具有相对分子质量88000的大蛋白质分子，至少包含有34条多肽链。分别由核和线粒体两个不同的基因组编码构成。在电子传递链中共有3个质子泵(protonpump)，该酶是第一个质子泵。NADH基因是在生物体内非常保守持家基因。通过定量PCR检测表明该基因在麦长管蚜不同温度处理下的无翅蚜体内均能稳定表达，为研究麦长管蚜功能基因及在不同温度处理下的无翅蚜体内的表达研究提供了非常理想的内参基因。
技术实现思路
本专利技术提供一种麦长管蚜不同温度处理下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用，以高温胁迫后的麦长管蚜为样本，以麦长管蚜热激蛋白hsp90为目的基因，筛选出的NADH基因为内参基因，研究了在高温胁迫下的麦长管蚜hsp90基因的表达规律，解决了麦长管蚜应对不同温度环境下内参基因的筛选问题，应用本专利技术可建立麦长管蚜成虫体内温度胁迫下不同内参基因的实时荧光定量PCR检测方法，为麦长管蚜不同温度处理下的内参基因的选择提供依据。本专利技术提供的技术方案是：不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法：以20℃饲养的麦长管蚜为对照，设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，处理后立刻提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR验证，采用RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因。上述不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，包括以下步骤：(1)麦长管蚜饲养：麦长管蚜为实验室饲养种群，饲养与人工气候箱中，饲养条件是20±2℃，湿度60-80％，光照为16h光照：8h黑暗；(2)设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，分别是18℃、24℃和30℃。(3)设计基因的荧光定量引物：从GneBanck数据和麦长管蚜转录组中获得麦长管蚜ACT、RpS27S、v-ATPase)、NADHdehydrogenase(NADH)、18SribosomalRNA(18S)和e本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于：以20℃饲养的麦长管蚜为对照，设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，处理后立刻提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR验证，采用RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于：以20℃饲养的麦长管蚜为对照，设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，处理后立刻提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR验证，采用RefFinder进行内参基因稳定性分析，从而筛选出在不同温度处理下麦长管蚜体内最适合、最稳定表达的内参基因。


2.根据权利要求1所述的不同温度处理下麦长管蚜内参基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）麦长管蚜饲养：麦长管蚜为实验室饲养种群，饲养与人工气候箱中，饲养条件是20±2℃，湿度60-80%，光照为16h光照：8h黑暗；
（2）设置3个温度梯度对麦长管蚜成虫进行处理，分别是18℃、24℃和30℃；
（3）设计基因的荧光定量引物：从GneBanck数据和麦长管蚜转录组中获得麦长管蚜ACT、RpS27S、v-ATPase、NADH、18S和EF1a候选内参基因和热激蛋白HSP90的核酸部分序列，利用UNAFold在线软件分析各基因核酸部分序列的二级结构，软件设置如下：meltingtemperature，60℃；DNAsequence，linear；Na+concentration，50mM；Mg2+concentration，3mM；其它选项为初始设置；获得各基因模板序列含有茎环结构的位点后，利用NCBI-Primer-BLAST在线软件设计引物，软件设置如下：primermeltingtemperature，57-63℃；primerGCcontent，40-60%；PCRproductsize，150-300basepairs；Excludedregions，茎环结构位点；其它选项为初始设置；设计获得各基因的特异性实时荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性及按5倍稀释cDNA分别进行定PCR建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；
（4）分别选取18℃、24℃和30℃处理麦长管蚜2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱勋，阎维巍，李祥瑞，张云慧，程登发，李新安，龚培盼，任智萌，王超，魏长平，杨超霞，李亚萍，殷新田，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11