一种DNA探针的制备方法及其用途技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种DNA探针的制备方法及其用途，即将载有目标序列的质粒通过酶切线性化后，通过荧光标记获得特殊的DNA探针。将获得的DNA探针进行荧光原位杂交检测，具有杂交信号强，背景杂信号弱等优势，适用于表达细胞中目标序列的定性、定量及相对定位等检测方面的应用。

Preparation and application of a DNA probe

【技术实现步骤摘要】
一种DNA探针的制备方法及其用途
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种DNA探针的制备方法及其用途。
技术介绍
基因工程(geneticengineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入宿主细胞(如细菌、动植物细胞等)，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。哺乳动物细胞是目前生物制药产业中常用的宿主细胞，其中最常用的是中华仓鼠卵巢(Chinese-hamsterovary,CHO)细胞。通过把外源目的基因稳定整合到CHO细胞基因组上的高表达位点，实现重组蛋白的高产。为了进一步提高靶基因的表达水平，人们常常通过采用二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)缺陷型CHO细胞系，在甲氨蝶呤的存在下，驱动载体DHFR基因带动外源基因扩增。然而在重组蛋白大规模生产阶段，由于不能持续使用甲氨蝶呤，获得扩增的外源基因面临减少或丢失的风险，因此检测外源基因在CHO细胞基因组的整合状态成为必要要求。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)作为基因工程的重要手段，是一种直观、灵敏、特异、安全的基因检测和定位技术，被广泛应用于细胞遗传学分析、遗传病诊断、基因图谱绘制等研究领域。随着生物制药产业的发展，FISH也逐渐被应用于检测工程细胞株中外源基因的定位整合情况。作为检测外源基因整合的方法，FISH较PCR、qPCR、Southernblot、Northernblot等方法更为直观，并可实现精确定位。这对研究外源基因的位置效应、提高外源基因的表达效率具有重要意义。探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键：用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。因此，为实现外源基因在表达用宿主细胞(如CHO细胞)中的定量、定性、定位检测，需要合适的DNA探针及相应的荧光原位杂交方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，在于提供一种DNA探针的制备方法，用于目标序列在表达用细胞中的定性、定量及相对定位分析检测。DNA探针的具体制备方法如下：(1)质粒DNA提取：将质粒中含目标序列的菌液经过培养后，进行质粒DNA提取；(2)酶切：用限制性内切酶对提取的质粒DNA进行酶切使之线性化；(3)纯化及定量：对步骤(2)的酶切产物进行纯化，并对线性化的质粒DNA进行定量；(4)荧光标记：对线性化质粒DNA进行荧光标记，获得DNA探针。上述DNA探针以载有目标序列的质粒经过荧光标记制备而得，相比于以PCR扩增片段(PCR模板为载有目标序列的质粒)进行荧光标记制备而得的DNA探针，能更真实反映目标序列在细胞中的转染情况。上述DNA探针的制备过程中，采用限制性内切酶将质粒DNA进行线性化后再进行荧光标记，能提高DNA探针的荧光标记效率和标记量，进而提高目标序列在表达用细胞中的检出强度。作为优选，步骤(1)中的目标序列为编码融合蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。作为优选，步骤(1)中的质粒DNA中含有卡那霉素抗性基因；步骤(2)中的限制性内切酶为FspI。卡那霉素抗性基因是一种应用广泛的抗性基因，在多种克隆载体或表达载体上都含有此抗性基因。卡那霉素抗性基因的核苷酸序列可以从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载，具体序列如SEQIDNO：2所示。上述DNA探针的制备过程中，采用特殊的限制性内切酶将质粒DNA进行线性化，酶切后的质粒DNA不会自连，避免DNA探针在后续的FISH检测过程中因自连而影响检测结果。作为优选方式，在DNA探针的制备方法中，步骤(4)中所述荧光标记的方法为随机引物法；所述荧光标记的试剂为Biotin-16-dUTP，荧光标记时，带标记的dUTP与dTTP的加入比例为1:1～2:1，更优选的带标记的dUTP与dTTP的加入比例为2:1。申请人在研究中发现：在荧光标记过程中，提高带标记的dUTP的量，会使更多带信号的dUTP取代正常dTTP的位置，使得FISH后期的信号放大有足够的位点进行染色，提高杂交信号强度；但不能继续提高带标记的dUTP的量，否则检测效果不佳，可能是因为带上了标记dUTP所占空间比例比正常dTTP大，过高的比例会使探针合成受阻不能形成完整的探针，从而影响检测结果。本专利技术的另一个目的是提供一种通过上述DNA探针的制备方法制备而成的DNA探针。本专利技术的另一个目的是提供一种上述DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的用途。所述的目标序列可以是编码一种蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO：1所示的融合蛋白，也可以是编码两种及以上蛋白的核苷酸序列。所述的表达用细胞为细菌细胞、动物细胞或植物细胞。作为优选方式，DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的用途，其检测包括以下步骤：a.染色体玻片的制备：用秋水仙素处理细胞，经过低渗、固定处理后，制备获得染色体玻片；b.DNA探针的制备：制备方法如上所述，获得DNA探针；c.杂交：对DNA探针进行变性处理，对染色体玻片进行变性及脱水处理，将变性的DNA探针滴于已变性并脱水的玻片标本上，进行杂交，获得杂交标本；d.荧光染色及信号放大：在杂交标本上依次加入荧光素标记的亲和素、生物素化的亲和素抗体、荧光素标记的亲和素分别进行反应，获得杂交信号放大的杂交标本，然后对杂交标本滴加与上述荧光素标记颜色不同的染色体复染剂进行复染；e.荧光显微镜观察：将复染后的杂交玻片置于荧光显微镜下观察。作为优选方式，上述用途的检测步骤中，染色体玻片的制备包括以下内容：a1.收集用秋水仙素处理后的细胞；a2.低渗处理：将收集的细胞用氯化钾溶液进行低渗处理；a3.一次固定：将低渗后的细胞中加入固定液进行一次固定处理，一次固定后离心收集细胞；a4.二次固定：将一次固定处理后的细胞中加入固定液进行二次固定处理，二次固定后离心收集细胞；a5.染色体玻片制备：将二次固定处理后的细胞中加入固定液配制成细胞悬液，将细胞悬液滴于载玻片中央，晾干，即获得染色体玻片；上述细胞为中华仓鼠卵巢细胞(即CHO细胞)。在重组蛋白质表达方面，CHO细胞是经常使用的细胞系。并且，基于大规模表达中多方面的需要对原始CHO细胞进行改造，从而得到了一系列针对特定表达目的的用于重组蛋白生产的衍生CHO细胞系，例如用于无血清培养等，这些都是在重组蛋白质表达领域公知的。本申请中涉及的CHO细胞可以为原始CHO细胞，也可以为针对特定表达目的而进行改造的衍生CHO细胞系。作为优选方式，上述用途的检测步骤中，固定液为甲醇与冰醋酸以体积比3:1混合的溶液；一次固定处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)质粒DNA提取：将质粒中含目标序列的菌液经过培养后，进行质粒DNA提取；/n(2)酶切：用限制性内切酶对提取的质粒DNA进行酶切使之线性化；/n(3)纯化及定量：对步骤(2)的酶切产物进行纯化，并对线性化的质粒DNA进行定量；/n(4)荧光标记：对线性化质粒DNA进行荧光标记，获得DNA探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)质粒DNA提取：将质粒中含目标序列的菌液经过培养后，进行质粒DNA提取；
(2)酶切：用限制性内切酶对提取的质粒DNA进行酶切使之线性化；
(3)纯化及定量：对步骤(2)的酶切产物进行纯化，并对线性化的质粒DNA进行定量；
(4)荧光标记：对线性化质粒DNA进行荧光标记，获得DNA探针。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述目标序列含有编码融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.根据权利要求1或2所述的DNA探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述质粒DNA中含有卡那霉素抗性基因；步骤(2)中所述限制性内切酶为FspI。


4.根据权利要求1所述的DNA探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述荧光标记的方法为随机引物法；所述荧光标记的试剂为Biotin-16-dUTP，所述荧光标记时，带标记的dUTP与dTTP的加入比例为1:1～2:1，优选为2:1。


5.一种权利要求1-4任一项所述的制备方法制备而成的DNA探针。


6.一种权利要求5所述的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的用途。


7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述检测包括以下步骤：
a.染色体玻片的制备：用秋水仙素处理表达用细胞，经过低渗、固定处理后，制备获得染色体玻片；
b.DNA探针的制备：制备方法如权利要求1-4任一项所述，获得DNA探针；...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯潇，罗祖秀，唐懿挺，
申请(专利权)人：成都康弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51