一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法技术

本发明专利技术属于脂溶性维生素检测前处理技术领域，具体涉及一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法。商品化的96孔板在样品前处理过程中具有重要的应用，发明专利技术人研究过程中发现，96孔收集板的材料对脂溶性维生素具有较高的非特异性吸附，包括后续的氮吹步骤均会对脂溶性维生素的检测造成影响。本发明专利技术提供了一种有效降低96孔板对脂溶性维生素非特异性吸附的方法，所述方法包括采用高压灭菌对96孔收集板进行预处理，经本发明专利技术研究验证，该处理方法能够有效降低96孔收集板对脂溶性维生素的特异性吸附，提高回收率。

A method of reducing nonspecific adsorption of fat soluble vitamin 96 pore plate

【技术实现步骤摘要】
一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法
本专利技术属于脂溶性维生素检测前处理
，具体涉及一种降低脂溶性维生素高效液相检测前、样品预处理时非特异性吸附的方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。脂溶性维生素(包括VA、VE、VK以及VD的主要代谢物25-OHVD2以及25-OHVD3)作为维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物，能够起到调节人体的各种生理机能，增强人体的免疫机能，在调节体内各方面的代谢作用具有重要作用，比如维生素A的缺乏，容易引起夜盲症，维生素D促进骨骼的发育，其缺乏容易引起佝偻病等。因此，定期检测人体内维生素水平，使其保持在正常范围内，进而确保顺利参与生理活动，具有重要意义。高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)因具有快速、高效和高灵敏度的优点，已成为脂溶性维生素类生物样品分析的标准检测手段。LC-MS系统作为功能强大且精细复杂的分析工具，对分析样品的纯度有较高要求。因此样品在进入液质联用系统前，需要对样品进行前处理过程。而前处理过程试剂及耗材的选择及使用会影响样品的前处理效果进而对性能指标如回收率等产生较大影响。目前样品前处理方法主要包括蛋白质沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)等。针对如上前处理方法已有商品化的96孔板如PPT、SLE、SPE及PLD等。针对上述脂溶性维生素的检测，在采用含水试剂进行处理的过程中，可能会造成乳相形成，96孔支撑液相萃取(SLE)微孔板将含水样品固定于惰性载体，使有机相流过从而消除了上述问题。前处理后的收集样品置于96孔收集板中可直接放置于高效液相自动进样器中进行检测。上述前处理过程涉及洗脱过程，以及后续的氮吹和复溶过程，如上过程需要有配套的96孔收集板，因此样品留存在96孔收集板中的时间较久，而在数次实验中发现脂溶性维生素回收率偏低，专利技术人分析原因可能是96孔收集板为塑料材质，容易与脂溶性维生素尤其是维生素D和维生素K发生非特异结合所致，上述器材的缺陷严重影响了检测的准确性。
技术实现思路
基于上述技术缺陷，本专利技术提供了一种降低树脂材质孔板对脂溶性维生素的非特异性吸附的方法，在加样之前对孔板进行高压灭菌，可以有效降低孔板对样品中脂溶性维生素成分的吸附，提高检测回收率。采用上述前处理方法，可以有效提高检测方法的准确性。基于上述研究成果，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供一种降低收集板非特异性吸附的方法，所述方法包括在加样之前采用高压灭菌方法对收集板进行预处理。优选的，所述高压灭菌温度为114～124℃。优选的，所述高压灭菌的时间为15～25min。优选的，所述收集板为96孔收集板。本专利技术第二方面，提供一种脂溶性维生素的样品前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：(1)对收集板进行高压灭菌处理；(2)将血清样品与内标工作液加入提取板中混匀；(3)将步骤(2)中的液体通过过滤板及正压装置转移至灭菌后的收集板中静置；(4)加入提取液，通过正压装置将洗脱液收集至灭菌后的收集板中，氮气吹干后复溶检测。优选的，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、维生素K、25-OHVD2、25-OHVD3。优选的，所述静置时间为5-10min。优选的，所述氮吹流量为1.8～2.2mL/min。优选的，所述氮吹时间为4～6min。本专利技术第三方面，提供一种脂溶性维生素的高效液相分析方法，所述分析方法包括采用第二方面所述脂溶性维生素的样品前处理方法对待测样品进行处理。优选的，所述分析包括采用液相-质谱进行检测。进一步优选的，所述液相条件如下：色谱柱为C18柱，流速：0.4～0.6mL/min；柱温：38～42℃。进一步优选的，所述液相流动相为：(A)-甲醇，(B)-0.1％甲酸水。进一步优选的，所述液相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-0.5min80％流动相B，0.5-2.0min98％流动相B，2.0-5.0min98％流动相B，5.0-6.0min80％流动相B，6.0-7.0minStop。进一步优选的，所述质谱采用电喷雾ESI源正离子方式。进一步优选的，所述质谱离子源温度为440～460℃。进一步优选的，所述质谱喷雾电压为5400～5600V。进一步优选的，所述质谱采用MRM模式采集数据。本专利技术第四方面，提供一种提高脂溶性维生素检测准确度的方法，所述方法包括采用第一方面所述降低收集板非特异性吸附的方法中的步骤。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.该方法能够有效的降低因96孔收集板为塑料材质而带来的非特异性吸附问题，大大降低了因96孔收集板对待测物质吸附的问题，有效提高样品的回收率。2.该方法取代了过去用玻璃瓶，无法实现高通量的问题，有效的提高了样品前处理的效率，同时降低了单个处理而产生的人为误差，提高了检测的准确度。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例1中用未处理的96孔收集板参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。图2为实施例1中高压灭菌(115℃，20min)处理的96孔收集板参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。图3为实施例1中高压灭菌(121℃，20min)处理的参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。图4为实施例1中为高压灭菌(121℃，30min)处理的参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本专利技术提出了一种降低脂溶性维生素高效液相检测前，样品预处理时非特异性吸附的方法。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本专利技术的技术方案。以下实施例中采用的立式压力蒸汽灭菌器为上海三申医疗器械有限公司，正压装置为山东英盛生物技术有限公司生产的YS-600。采用的液质联用系统为山东英盛生物技术有限公司生产的YSEX本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低收集板非特异性吸附的方法，其特征在于，所述方法包括在加样之前采用高压灭菌方法对收集板进行预处理；/n优选的，所述高压灭菌温度为114～124℃；/n优选的，所述高压灭菌的时间为15～25min；/n优选的，所述收集板为96孔收集板。/n

【技术特征摘要】
1.一种降低收集板非特异性吸附的方法，其特征在于，所述方法包括在加样之前采用高压灭菌方法对收集板进行预处理；
优选的，所述高压灭菌温度为114～124℃；
优选的，所述高压灭菌的时间为15～25min；
优选的，所述收集板为96孔收集板。


2.一种脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述前处理方法包括以下步骤：
(1)对收集板进行高压灭菌处理；
(2)将血清样品与内标工作液加入提取板中混均；
(3)将步骤(2)中的液体通过过滤板及正压装置转移至灭菌后的收集板中静置；
(4)加入提取液，通过正压装置将洗脱液收集至灭菌后的收集板中，氮气吹干后复溶检测。


3.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、维生素K、25-OHVD2、25-OHVD3。


4.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述静置时间为5-10min。


5.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述氮吹流量为1.8～2.2mL/min；或所述氮吹时间为4～6min。


6.一种脂溶性维生素的高效液相分...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，景叶松，弭兆元，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37