LC-MS/MS测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法技术

本发明专利技术属于分析检测领域，提供了一种LC

【技术实现步骤摘要】
LC
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MS/MS测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法


[0001]本专利技术属于分析检测领域，特别涉及一种非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]甲基丙二酸(Methylmalonic acid，MMA)是一种二羧酸，是丙二酸的甲基化衍生物，琥珀酸(Succinic Acid，SA)的同分异构体。甲基丙二酸是钴胺素代谢缺陷和甲基丙二酸血症的特征标志物。人血清中甲基丙二酸的正常含量低于0.4μMol/L，如果甲基丙二酸浓度超过0.4μMol/L是维生素B12缺乏的表征，如果血清中甲基丙二酸浓度超过40μMol/L，则提示有很大的甲基丙二酸血症的风险。
[0004]在生物体内，甲基丙二酸与辅酶A通过硫酯键结合成甲基丙二酰辅酶A，再以维生素B12为辅酶通过甲基丙二酰辅酶A变位酶异构化为琥珀酰辅酶A，血清中维生素B12水平直接反应了循环维生素B12浓度，而甲基丙二酸累积会导致维生素B12缺乏，是反应维生素B12状态的功能性标志物，同时维生素B12缺乏会影响同型半胱氨酸的代谢，与心脑血管疾病有很大的相关性。甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia，MMA)是一种常见的有机酸血症，主要由于甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶钴胺素维生素B12代谢缺陷所致。
[0005]维生素B12、总同型半胱氨酸及甲基丙二酸对于早期诊断维生素B12缺乏都是非常有帮助的指标，直接的维生素B12检测是最常用的测试方法，它通过自动化免疫的方法直接测定全钴胺素和全钴胺素蛋白的总和，因此免疫的方法对标志物测定缺乏特异性。近年来的研究表明甲基丙二酸是比维生素B12、总同型半胱氨酸更敏感，更具有代表性的生物标志物。
[0006]目前没有比较经济的免疫方法来定量甲基丙二酸，常见的测试甲基丙二酸方法是气相色谱
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质谱法(GC
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MS)和液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)。
[0007]气相色谱
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质谱法(GC
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MS)是检测甲基丙二酸的金标准，准确度高，特异性好；然而此方法有其缺点：1)成本高；2)前处理步骤繁琐；3)消耗样本体积大；4)分析时间长。
[0008]液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)因准确度高、特异性好等优势近年来越来越多的应用到甲基丙二酸的检测中，在前处理方法上有衍生化方法、非衍生化方法以及不同复杂程度的样本提取过程。同气相色谱
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质谱法相比，液相色谱
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串联质谱法更大程度上减少了样本前处理步骤，虽然在固相萃取、衍生化反应、蛋白沉淀或者超滤等方法中至少选择了1种，且加热、蒸发、孵育、氮吹浓缩或者离心步骤是其必须步骤之一。
[0009]甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离是现有液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)检测甲基丙二酸的难点和挑战之一，它们具有相似的理化性质和接近的质谱特征碎片，
且琥珀酸在生物体内的含量等同甚至高于甲基丙二酸，这对检测的特异性提出了很高的要求。大部分液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)采用衍生化的前处理方法实现甲基丙二酸和其同分异构体的分离，在衍生化的基础上又增加了氮吹浓缩的操作，前处理步骤相对繁琐，增加了分析时间。在检测通量或者检测项目上，绝大部分方法采取甲基丙二酸单独检测的形式，不能涵盖代谢通路上的其它指标，如果检测其它指标还需二次检测，造成检测成本提高，液相色谱
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串联质谱法也失去了高检测通量的优势。

技术实现思路

[0010]为了解决上述问题，本专利技术提供一种非衍生化的方法及试剂盒直接检测人血清中的甲基丙二酸含量，实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离，并同时检测人血清中同型半胱氨酸和其它代谢产物(蛋氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、4
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吡哆酸、5
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磷酸吡哆醛)含量。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]本专利技术的第一个方面，提供了一种非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，包括：
[0013]将血清样本进行前处理，加入还原剂涡旋混匀，孵育15～20min后，加入提取液，涡旋混匀5～6min后，离心，取上清液过滤板、再次离心，收集上清液，即为待测液；
[0014]分别配制标准工作液和内标品混合溶液；
[0015]采用液相色谱串联质谱法对待测物质进行定性与定检测，将待测样本通过色谱柱分离后，甲基丙二酸及其内标采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，其它化合物及其内标采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，即得。
[0016]本专利技术所述液相色谱
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串联质谱方法(LC
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MS/MS)及试剂盒，前处理操作简单便捷，只需要通过一步提取即可实现目标物的检测，不需要氮吹浓缩；前处理不需要通过衍生化的方法，仅通过优化色谱条件，即可实现甲基丙二酸和琥珀酸同分异构体的分离；一步提取，非衍生化样本前处理，大幅度缩短了样本检测时间，实现了甲基丙二酸的特异性检测，提高了检测的准确度；同时可兼顾同型半胱氨酸及其相关代谢物(蛋氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、4
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吡哆酸、5
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磷酸吡哆醛)的检测，为同型半胱氨酸血症的诊疗提供辅助手段。
[0017]本专利技术的第二个方面，提供了一种非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物的检测试剂盒，包括：校准品、校准品稀释液、质控品、内标物、还原剂：40～60mg/mL二硫苏糖醇、提取液：10～12％三氯乙酸。
[0018]本专利技术的第三个方面，提供了上述的试剂盒在甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物同时测定中的应用。
[0019]本专利技术的有益效果
[0020](1)本专利技术对前处理方法进行改良，不需要氮吹浓缩的前处理过程，只需要通过一步提取即可实现甲基丙二酸等7种目标化合物的检测；不需要甲基丙二酸的衍生化反应，仅通过调整流动相配方及使用Gemini 3μm NX
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C18
[0021]110A,100x2mm色谱柱，即可实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的有效分离；整个前处理过程步骤简单，方便快捷，大幅度缩短了样本检测时间，容易实现批量处理。
[0022]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，包括：将血清样本进行前处理，加入还原剂涡旋混匀，孵育15～20min后，加入提取液，涡旋混匀5～6min后，离心，取上清液过滤板、再次离心，收集上清液，即为待测液；分别配制标准工作液和内标品混合溶液；采用液相色谱串联质谱法对待测物质进行定性与定检测，将待测样本通过色谱柱分离后，甲基丙二酸及其内标采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，其它化合物及其内标采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，即得；其中，所述相关代谢产物选自：蛋氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、4
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吡哆酸、5
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磷酸吡哆醛中至少一种。2.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇，用量为40～60mg/mL。3.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述提取液为三氯乙酸，浓度为10～12％。4.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述离心的条件为14000～15000rpm，4～5℃下离心15～20min。5.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述再次离心采用板式离心机，3500～4000rpm离心10～15min。6.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱
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串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，各分析物同位素内标为：甲基丙二酸
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D3、同型半胱氨酸
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D4、甲蛋氨酸
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D3、叶酸
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D4、5
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甲基四氢叶酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：景叶松，路颖，朱蓉，郭启雷，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：