基于LC-MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法技术

本发明专利技术属于生物医学工程技术领域，涉及人血清中维生素的检测，具体涉及基于LC

【技术实现步骤摘要】
基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法


[0001]本专利技术属于生物医学工程
，涉及人血清中维生素的检测，具体涉及基于LC
‑
MS(液相色谱串联质谱)同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]维生素B1(硫胺素)是糖酵解中多种脱氢酶的辅酸，也是合成核酸、脂肪酸中必不可少的物质，能催化某些部分氨基酸氧化，可维持神经、消化等正常功能。维生素B2即核黄素，是黄素酶辅基的主要组成部分，参与机体复杂的生物氧化过程，具有较强的抗氧化能力。维生素B3是生物体内辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的重要组成成分，参与体内脂质代谢、组织呼吸氧化过程和糖类无氧分解代谢等。维生素B3是NAD
+
的活性前体物质，主要包括两种形式：烟酸(nicotinic acid,NA)和烟酰胺(nicotinamide,NAM)。维生素B5(泛酸)缺乏会导致痛风或风湿性关节炎、低血糖等；维生素B6(体内活性形式包括吡哆醛PL和磷酸吡哆醛PLP，主要代谢产物是吡哆酸4
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PA)缺乏会导致慢性炎症，神经兴奋性增强、烦躁不安、睡眠不安、全身性抽搐等，维生素B6在临床使用较为广泛，常用于脂溢性皮炎、原发性痛经、妊娠呕吐、儿童癫痫等疾病的治疗。临床相关研究表明维生素B7(生物素)可以促进神经组织、汗腺、骨髓等多种器官的健康发育，同时可以保护皮肤和毛发的完整结构，保证其生长和代谢，因此临床多被用于治疗多种皮炎、湿疹和脱发。维生素B9(叶酸FA，5
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甲基四氢叶酸5
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MTHF是其体内活性形式)吸收后合成四氢叶酸，它是一碳单位的辅酶，参与合成体内多种物质，特别是胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成。维生素B12(钴胺素)经胃肠道内源因子及相关转运蛋白吸收转运后作为甲基供体参与多种核酸、蛋白质合成，并可以促进体内叶酸的利用。维生素B12的缺乏主要反映在血液及神经系统,会导致恶性贫血、老年痴呆及精神抑郁等疾病。有研究证实有些血清维生素B12轻度降低的老年人，其血清中甲基丙二酸(MMA)已明显增高，提示代谢物MMA测定较血清维生素B12更为敏感，并且血清MMA测定还可以作为判断维生素B12补给量是否充足的标准。维生素C又称L
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抗坏血酸，是抗氧化剂，能抑制细胞释放氧，清除细胞内外氧自由基，参与体内氧化
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还原强化反应，发挥抗氧化作用，可有效缓解自由基对肠道黏膜的损伤。综上，对于体内水溶性维生素的含量进行检测具有重要的意义。
[0004]据专利技术人研究了解，大多数用于水溶性维生素的现代方法依赖于液相色谱与紫外、荧光、二极管阵列和电化学检测技术等。水溶性维生素因其特性：极性大、与水相溶、不同的水溶性维生素其浓度含量各异、不同的水溶性维生素特性各异、在血清中浓度含量极低不易被检测。因此，对于血清中VB1、VB2、VB5、VB7、VC、NA、NAM、4
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PA、PL、PLP、FA、5
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MTHF、VB12、MMA的14种水溶性维生素，需要提供一种高效准确的检测方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，本专利技术提供的方法提取过程简便，能够实现对人血清中VB1、VB2、VB5、VB7、VC、NA、NAM、4
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PA、PL、PLP、FA、5
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MTHF、VB12、MMA的14种水溶性维生素进行高效准确的检测。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]一方面，一种基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，采用提取液对待测血清样品进行提取，离心分离后取上清液作为待测液；利用液相色谱串联质谱法对待测液进行检测分析；
[0008]其中，所述提取液为氢氧化钠甲醇(氢氧化钠的甲醇溶液)与乙腈的混合物，氢氧化钠甲醇与乙腈的体积比为0.5:9.5～1.5:8.5，氢氧化钠甲醇中氢氧化钠的浓度为4～6mM(mmol/L)；液相色谱串联质谱法中，采用的色谱柱为PC HILIC柱，流动相A为含有氟化铵和甲酸的甲酸铵水溶液，流动相B为含有甲酸的甲酸铵甲醇溶液，流动相A中氟化铵的质量百分含量为0.1～1％，流动相A中甲酸的质量百分含量为0.2～1％，甲酸铵水溶液的浓度为2～15mM，流动相B中甲酸的质量百分含量为0.2～1％，甲酸铵甲醇溶液的浓度为2～15mM。
[0009]由于不同的水溶性维生素其浓度含量各异、不同的水溶性维生素特性各异、在血清中浓度含量极低不易被检测，本专利技术从前处理、色谱柱选择、流动相组成进行解决。首先，针对人血清中VB1、VB2、VB5、VB7、VC、NA、NAM、4
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PA、PL、PLP、FA、5
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MTHF、VB12、MMA的14种水溶性维生素，本专利技术研究发现，从人血清中提取该14种水溶性维生素时，MMA的提取效率最低，为了在保证其他水溶性维生素的提取效率的前提下，尽可能提高MMA的提取效率，本专利技术对前处理时采用的提取液组成进行研究，研究对象包括甲醇、乙腈、甲醇和乙腈的混合物、乙酸甲醇溶液和水的混合物、甲酸乙腈溶液和乙酸锌乙腈溶液的混合物、氢氧化钠甲醇和乙腈的混合物等等，研究发现，当氢氧化钠甲醇与乙腈的体积比为0.5:9.5～1.5:8.5的混合物作为提取液时，能够在保证其他水溶性维生素的提取效率的前提下，MMA的提取效率更高，比其他提取液的提取效率高一个数量级。
[0010]其次，在具体进行液相色谱串联质谱法检测时，发现色谱柱对VB1、VB2、VB5、VB7、VC、NA、NAM、4
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PA、PL、PLP、FA、5
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MTHF、VB12、MMA的14种水溶性维生素的分离影响较大，通过对Titank C18柱、C18
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AQ柱、BP
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C18柱、PC HILIC柱、CORE ADME柱和NH2UG80柱的研究发现，只有PC HILIC柱能够同时对14种目标水溶性维生素进行分离。
[0011]再次，由于MMA为负离子，正负同扫有困难，因此在流动相中尝试加入氟化铵和甲酸，提高MMA的信号响应。另外，分别尝试加入不同浓度的甲酸铵和乙酸铵，分析发现乙酸铵含量为10mM会降低磷酸吡哆醛的响应，加酸会降低烟酸、MMA的响应，甲酸铵含量为2mM以下时MMA响应低。因此，选择加入氟化铵，氟化铵会使MMA响应变高，另外加入甲酸，增大磷酸吡哆醛的响应。
[0012]另一方面，一种基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的检测试剂盒，包括用作提取液的溶液、PC HILIC柱和用作流动相的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，其特征是，采用提取液对待测血清样品进行提取，离心分离后取上清液作为待测液；利用液相色谱串联质谱法对待测液进行检测分析；其中，所述提取液为氢氧化钠甲醇与乙腈的混合物，氢氧化钠甲醇与乙腈的体积比为0.5:9.5～1.5:8.5，氢氧化钠甲醇中氢氧化钠的浓度为4～6mM；液相色谱串联质谱法中，采用的色谱柱为PC HILIC柱，流动相A为含有氟化铵和甲酸的甲酸铵水溶液，流动相B为含有甲酸的甲酸铵甲醇溶液，流动相A中氟化铵的质量百分含量为0.1～1％，流动相A中甲酸的质量百分含量为0.2～1％，甲酸铵水溶液的浓度为2～15mM，流动相B中甲酸的质量百分含量为0.2～1％，甲酸铵甲醇溶液的浓度为2～15mM。2.如权利要求1所述的基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，其特征是，采用同位素内标法进行定量。3.如权利要求1所述的基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，其特征是，液相色谱的梯度洗脱程序为：0
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1min，1％B；1
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3.2min，1％B
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45％B；3.2
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4.5min，45％B；4.5
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5min，45％B
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98％B；5
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5.5min，98％B；或，液相色谱的流速为0.2～0.4mL/min；或，液相色谱中，柱温为28～32℃，进样量为5～15μL。4.如权利要求1所述的基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，其特征是，质谱条件为：电喷雾离子源，正负离子MRM扫描分析，离子源参数：正模式电压值3400～3600V，负模式电压值2400～2600V，鞘气：44～46Arb，辅助气：14～16Arb，吹扫气：0Arb，离子传输管温度：310～330℃，离子源温度：440～450℃。5.如权利要求1所述的基于LC
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MS同时检测人血清中多种水溶性维生素的方法，其特征是，质谱中，VB1的母离子质荷比为265，VB1的子离子质荷比为122，VB1
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IS的母离子质荷比为268，VB1
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IS的子离子质荷比为122，VB2的母离子质荷比为377，VB2的子离子质荷比为243，VB2
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IS的母离子质荷比为383，VB2
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IS的子离子质荷比为249，NAM的母离子质荷比为123，NAM的子离子质荷比为80，NAM
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IS的母离子质荷比为127，NAM
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IS的子离子质荷比为84，NA的母离子质荷比为124，NA的子离子质荷比为80，NA
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IS的母离子质荷比为128，NA
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IS的子离子质荷比为84，VB5的母离子质荷比为220，VB5的子离子质荷比为90，VB5
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IS的母离子质荷比为224，VB5
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IS的子离子质荷比为94，4
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PA的母离子质荷比为184，4
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PA的子离子质荷比为148，4
‑
PA
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IS的母离子质荷比为187，4
‑
PA
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【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，孙越，刘双双，郭启雷，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：