一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法及预处理试剂盒技术

本发明专利技术属于儿茶酚胺检测预处理技术领域，具体涉及一种儿茶酚胺的LC‑MS/MS检测方法及预处理试剂盒。血液中儿茶酚胺含量降低，并且极易被氧化，4℃避光条件下半衰期仅为12h难以满足高通量检测的需要。本发明专利技术提供了一种儿茶酚胺的LC‑MS/MS检测方法及预处理试剂盒，通过优化提取方法及加入稳定剂，提升了对血液样品中儿茶酚胺类物质的提取效果和稳定效果，使其在样品预处理之后的24h内都能够维持稳定，满足高通量检测的需要。

LC-MS / MS detection method and pretreatment kit for catecholamine

【技术实现步骤摘要】
一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法及预处理试剂盒
本专利技术属于儿茶酚胺检测预处理
，具体涉及一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法及预处理试剂盒。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。儿茶酚胺(Catecholamines,CAs)是一类含有二羟基苯基的胺类化合物，是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。其主要包括肾上腺素(Epinephrine,E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)。儿茶酚胺类物质作为神经递质和激素物质，具有较强的生理学活性，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆和尿液中CAs及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。儿茶酚胺类物质，作为维持人体正常运转的重要神经递质，与神经内分泌疾病有重要的相关性。目前，临床上关于儿茶酚胺类及其代谢物质在人体内含量的检测，主要是用于嗜铬细胞瘤或副神经节瘤的诊断筛查；神经母细胞瘤及相关肿瘤诊断及复查；评价自主神经功能障碍、自主神经功能衰竭、自主神经功能病变。临床研究发现检测生物样本中的CAs水平不仅对于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义，并且有助于甲状腺功能异常、充血性心力衰竭、糖尿病、肾脏功能不全等疾病的诊断。同时，对于神经电生理等基础医学研究也具有重要的意义。目前，国内外检测血液中儿茶酚胺类物质的方法有荧光法、放射免疫法、生物法及高效液相色谱法等。其中荧光法的检测限较高，使得测定时的灵敏度达不到要求；放射免疫法的操作步骤繁琐，价格也比较昂贵，难以在临床上推广普及。高效液相色谱-串联质谱法不仅具有高效、高通量、高灵敏度、高特异性等优点，而且针对离子对进行检测，特异性高，能够避免交叉反应的干扰，检测结果更加准确可靠，成为研究儿茶酚胺类物质的首选方法。但是，人体内儿茶酚胺类不仅含量相对较低，且极易被氧化，在血液中的半衰期短。抽取后的血液样本在在-20℃及以下稳定保存三天，将血液样本中的儿茶酚胺提取后，在4℃避光条件下半衰期仅为12h。当采用高效液相色谱串联质谱进行高通量检测时，检测样本量大，假设每个样本检测需要10min，60个样本的检测需要至少10个小时，这样就造成提取后的样本检测排序的先后顺序造成检测样本的准确性差。而且儿茶酚胺类物质在人体中的含量很低，提取过程中的损失及样本提取后的稳定性问题成为应用LC-MS/MS检测人体血液样本中儿茶酚胺含量的难题。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术提供了一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法，通过优化提取方法，保证了血液中儿茶酚胺的良好回收率，降低基质效应；另外通过加入稳定剂的方式有效的维持血液样品中儿茶酚胺的稳定，以满足高通量检测的要求，保证了检测的准确性。基于上述研究成果，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供一种血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，所述预处理方法包括以下步骤：向待处理血液样品中加入稳定剂、内标液及甲酸水混均后离心，取上清部分经弱阳离子交换后再加入淋洗液进行淋洗，吹干后加入洗脱液进行检测。优选的，所述稳定剂为EDTA、草酸及巯基乙醇的混合溶液。进一步优选的，所述稳定剂中，EDTA、草酸及巯基乙醇的摩尔比为1.8～2.2:0.8～1.2:0.8～1.2。本专利技术通过优化稳定剂的组成和配比，得到的上述稳定剂配方，在不影响儿茶酚胺的LC-MS/MS检测的同时，能够增加了儿茶酚胺类物质的稳定性，使样品提取过程最大程度的减少损失，样品提取后能够在24h内保持稳定。进一步优选的，所述内标液为氘代甲基氢多巴胺标准品、氘代甲基氢肾上腺和氘代去甲肾上腺素标准品的混合液。进一步优选的，所述甲酸水浓度为0.08～0.12％。进一步优选的，所述离心采用11000～13000rpm离心1.5～2.5min。进一步优选的，所述淋洗液依次为乙酸铵、异丙醇及二氯甲烷。在一些具体的实施例中，所述淋洗的具体步骤如下：依次加入8～12mM乙酸铵，正压25～35s；再加入异丙醇，正压25～35s后吹干；再加入二氯甲烷静置1.5～2.5min，正压25～35s后吹干。进一步优选的，所述洗脱液为含0.2％甲酸的水与甲醇的混合溶液。在一些具体的实施例中，所述0.2％甲酸的水：甲醇体积比为85～95：5～15。儿茶酚胺在人体血液中含量极低，正常人含量在pg/ml级别，血液样品中的基质会对儿茶酚胺的质谱检测造成很大的干扰，通过优化提取方法，既能有效降低基质效应，而且可以最大程度保证儿茶酚胺从血液中提取。通过加入稳定剂，既可以减少提取过程中造成的儿茶酚胺氧化分解，而且提取后的儿茶酚胺在4℃环境避光稳定24h，因此在进行高通量样本检测时，可以保证样本中儿茶酚胺的含量不会因为进样时间的差异造成损失，从而保证了儿茶酚胺定量的准确性。另外，本专利技术提供的提取方法最后一步洗脱后，无需氮吹复溶，大大缩短了提取时间，单一样本提取只需15-20min，配合弱阳离子交换96孔板，可以实现样品的批量处理。本专利技术第二方面，提供一种儿茶酚胺预处理试剂盒，所述试剂盒中包括稳定剂、内标液、弱阳离子交换板、淋洗液及洗脱液。优选的，所述试剂盒的使用方法依照第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法的步骤进行。本专利技术第三方面，提供一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法，所述检测方法包括以下步骤：通过第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法获取待测血液样品，通过液相-二级质谱对待测血液样品进行检测。优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：通过第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法获取待测血液样品，配置标准工作液及质控品，通过检测标准品获取浓度与峰面积的对应关系制作标准曲线，经液相-二级质谱对待测血液样品进行检测获得相应的儿茶酚胺浓度。进一步优选的，所述标准工作液及质控品采用牛血清白蛋白(BSA)作为空白基质进一步优选的，所述高效液相的流动相如下，流动相A：含有0.2％甲酸0.05mM甲酸铵的水溶液；流动相B：含有0.2％甲酸的甲醇：乙腈(8：2，v/v)溶液。进一步优选的，所述液相色谱柱采用五氟苯基(PFP)色谱柱。进一步优选的，所述液相采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱程序如下：0.0～1.0min，1％B；1.0min～1.5min，至60％B；1.5～3.0min，60％B；3.0min～3.1min，至98％B；3.1～5.0min，98％B；5.0～5.1min，至1％B；7.1～7.0min，1％B。进一步优选的，所述质谱采用正离子电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括以下步骤：/n向待处理血液样品中加入稳定剂、内标液及甲酸水混均后离心，取上清部分经弱阳离子交换后再加入淋洗液进行淋洗，吹干后加入洗脱液进行检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括以下步骤：
向待处理血液样品中加入稳定剂、内标液及甲酸水混均后离心，取上清部分经弱阳离子交换后再加入淋洗液进行淋洗，吹干后加入洗脱液进行检测。


2.如权利要求1所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述稳定剂为EDTA、草酸及巯基乙醇的混合溶液；优选的，所述稳定剂中，EDTA、草酸及巯基乙醇的摩尔比为1.8～2.2:0.8～1.2:0.8～1.2。


3.如权利要求1所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述内标液为氘代甲基氢多巴胺标准品、氘代甲基氢肾上腺和氘代去甲肾上腺素标准品的混合液。


4.如权利要求1所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述甲酸水浓度为0.08～0.12％；或所述离心采用11000～13000rpm离心1.5～2.5min。


5.如权利要求1所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述淋洗液依次为乙酸铵、异丙醇及二氯甲烷；优选的，所述淋洗的具体步骤如下：
依次加入8～12mM乙酸铵，正压25～35s；再加入异丙醇，正压25～35s后吹干；再加入二氯甲烷静置1.5～2.5min，正压25～35s后吹干。


6.如权利要求1所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，其特征在于，所述洗脱液为含0.2％甲酸的水与甲醇的混合溶液；优选的，所述0.2％甲酸的水：甲醇体积比为85～95：5～15。


7.一种儿茶酚胺预处理试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括稳定剂、内标液、弱阳离子交换板、...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，景叶松，弭兆元，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37