本发明专利技术提供一种5α‑还原酶突变体，通过定点突变改造的5α‑还原酶获得5α‑还原酶突变体，构建其基因工程菌并应用在高效催化5α‑AD生产中的应用，定点突变改造的5α‑还原酶是将第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，将5α‑还原酶突变体重组质粒电转至分枝杆菌中进行异源表达，再对其酶活性和生产效率进行测定，发现5α‑还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌酶活力提高了2.3倍，其催化效率提高了22.8％，对5α‑AD的生产由原来的1.45g/L提高到了1.78g/L；将5α‑还原酶突变体作为重要甾体药物中间体生产的关键酶，可以明显提高生物转化的效率和产品的得率。
A 5 \u03b1 - reductase mutant, genetically engineered bacteria and its application in the production of 5 \u03b1 - Ad
【技术实现步骤摘要】
一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用
本专利技术属于基因工程领域，尤其是涉及一种5α-还原酶突变体及其在高效催化5α-AD生产中的应用。
技术介绍
甾体5α-还原酶属于还原型辅酶II(NADPH)依赖型酶，其能够催化一系列类固醇底物在4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成在α位上成为相应的5α-还原产物。例如，睾酮(TS)在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮(DHT)，其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用；雄甾-4-烯-3,17二酮(AD)能够在类固醇5α-还原酶的催化作用被还原为重要的甾体药物中间体：5α-雄烯二酮(5α-AD)中间体。一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-AD，但化学法往往伴随着反应步骤多、环境污染大、过程不好控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但现已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。随着人们对5α-还原酶的功能和作用机理的认识的不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。目前关于5α-还原酶的分子改造，主要是对底物睾酮的酶活力研究，而且其催化效率并不理想；5α-还原酶是催化AD生产5α-AD的关键酶，目前针对底物AD的5α-还原酶基因的改造还没有报道。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种5α-还原酶突变体，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生产中的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种5α-还原酶突变体，将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸。优选地，将序列如SEQIDNO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，5α-还原酶突变体序列如SEQIDNO.4所示。一种编码5α-还原酶突变体的基因序列，序列如SEQIDNO.3所示。一种包含5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，通过重叠延伸PCR进行定点突变获得5α-还原酶突变体重组表达载体，转入到主产AD的分枝杆菌中获得5α-还原酶突变体的基因工程菌；优选地，表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。优选地，主产AD的分枝杆菌为MNRM3△ksdd。具体制备方法如下：步骤一将5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F；步骤三将5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F电转到主产AD的分枝杆菌MNRM3△ksdd，获得5α-还原酶突变体的分枝杆菌基因工程菌MNRM3△ksdd/pMV261-5αY187F；优选地，步骤一中5α-还原酶基因片段序列如SEQIDNO.1所示；优选地，步骤二中引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。一种包含5α-还原酶突变体的重组表达载体；优选地，表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。一种包含5α-还原酶突变体的基因工程菌；优选地，宿主菌为主产AD的分枝杆菌为MNRM3△ksdd。5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法制备所得的5α-还原酶突变体的基因工程菌在5α-AD生产中的应用。优选地，利用5α-还原酶突变体基因工程菌发酵制备5α-AD，按8％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-8d。优选地，发酵培养基组成为：K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，其余为水，pH6.5-7.8。本专利技术具有的优点和积极效果是：在5α-还原酶基础上，通过定点突变生物技术改造5α-还原酶分子结构，通过质粒pMV261，在主产AD的分枝杆菌中实现了5α-还原酶突变体的成功表达，得到一株5α-还原酶分枝杆菌工程菌株，提高了其在分枝杆菌中的5α-还原酶酶活力，突变酶酶活力提高了2.3倍，也提高了5α-AD的产量，其催化效率提高了22.8％，对5α-雄烯二酮的产量由原来的1.45g/L提高到了1.78g/L；本专利技术解决了5α-还原酶催化活性低的限制问题，为5α-还原酶的分子改造提供了一条新的思路。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的一个实施例做出说明。一种5α-还原酶突变体，将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸，使其能够提高酶活力，在5α-AD生产中实现高效催化。具体为将序列如SEQIDNO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，从而形成5α-还原酶突变体，5α-还原酶突变体序列如SEQIDNO.4所示。5α-还原酶基因序列和氨基酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，5α-还原酶突变体基因序列和氨基酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示.SEQIDNO.1ATGGAGCGGCTCATCTTCATCTTCAACATCACCCAGATCGTCCTCTTCGGCGTCGGTCTGATCTGCTTTGTGGTGCTGTTCTTCGTCCCGGCGGGCTACGGCAAGATGATCAACAAGAAGTGGGGCTTCTCGTTCAACAACAAGATCGCTTGGTTTTTAATGGAGGTGCCGACTTTAATCACCATGATCGTTTTAATGTGCGTGTGGGCCAAGCCCGAGAACTTCGTGCGGATCATCATCGGTTTATTCTTCGTGCTGCATTACGCCCAGCGGGTGTTCATCTTCCCCTTTTTACTGAAGGGCAAGTCCAAGATGCCGATTTTAATCGTGCTGATGGGCATCACCTTCAACACCATCAACGCCTTTTTAATCGGTGCTTGGCTCTTTTATTTATCGCCCAAGACCATGTACCCGATCTCTTGGCTGTACGACCCGCGCTTCATCATCGGTGCCCTCGTGTTTTTACTGGGCATGGCCATCAACATCGACTCGGACAAGTACATCCGCTCGCTGCGCAAGCCGGGTGACACCGCCCACTACTTCCCCCACAAGCGGATGTACAAGTACGTCTCCTCGGCCAACTACTTCGGTGAGATTTTAGAGTGGTTCGGCTTCGCTTTACTGTCGTGGTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种5α-还原酶突变体，其特征在于：将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸。/n
【技术特征摘要】
20190423 CN 20191032663871.一种5α-还原酶突变体，其特征在于：将5α-还原酶中的一个酪氨酸突变为苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的5α-还原酶突变体，其特征在于：将序列如SEQIDNO.2所示的的5α-还原酶中第187位酪氨酸突变为苯丙氨酸，5α-还原酶突变体序列如SEQIDNO.4所示。
3.一种编码权利要求1或2所述的5α-还原酶突变体的基因序列，其特征在于：序列如SEQIDNO.3所示。
4.一种包含权利要求1或2所述的5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，其特征在于：将5α-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，通过重叠延伸PCR进行定点突变获得5α-还原酶突变体重组表达载体，转入到主产AD的分枝杆菌中获得5α-还原酶突变体的基因工程菌；
优选地，所述表达载体是大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261。
优选地，所述主产AD的分枝杆菌为MNRM3△ksdd。
5.根据权利要求4所述的5α-还原酶突变体的基因工程菌的制备方法，其特征在于：具体制备方法如下：
步骤一将5α-还原酶基因片段与表达载体pMV261连接构建得到重组质粒pMV261-5α；
步骤二以重组质粒pMV261-5α为模板，设计引物进行重叠延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pMV261-5αY187F；
步骤三将5α-还原酶突变体重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，申雁冰，任小贤，赵云秋，骆健美，夏梦雷，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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