一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶制造技术

本发明专利技术提供了一种黄酮合酶及其在黄酮糖苷类化合物的应用。所述黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。该黄酮合酶可实现包括橙皮苷在内的多种黄酮类糖苷化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率，具有优于现有的化学合成方法，能够用于黄酮类化合物细胞工厂的构建与优化。

A flavone synthetase for the synthesis of flavone glycosides

【技术实现步骤摘要】
一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶
本专利技术涉及生物酶
，特别涉及一种黄酮合酶，以及该黄酮合酶的应用。
技术介绍
黄酮类化合物是结构多样性高的重要植物天然化合物，目前已经分离到了9000多种不同结构的黄酮类化合物，按结构可以分为黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavone)、黄烷醇(flavanols)、黄酮醇(flavonols)和花青素(anthocyanidines)等不同类型。黄酮类化合物除少数游离外，大多与糖结合成苷。黄酮类化合物不但对于植物的生理、生态和农业有广泛的用途，而且在癌症和心血管等疾病防治方面也显著的疗。例如，地奥司明(Diosmin)是黄酮类化合物中的一种天然成分，存在于植物、水果和蔬菜中，蓬子菜、柑橘果实果皮等多种药食同源的天然植物中含量丰富，具有改善糖脂代谢，降低血糖、降血脂、预防尿酸、增加静脉张力，保护血管、抗炎、抗氧化、减少红细胞聚集、降低血沉及抗血栓等药理功效，被广泛用于治疗静脉疾病、急性痔疮、神经病理性疼痛、减轻局部炎症、作为微循环调节剂减轻慢性非细菌性前列腺炎组织炎症反应，改善前列腺组织的病理损伤，对前列腺组织起到明显保护作用等方面(朱春华等，香叶木苷的生物合成及其抗肿瘤活性，公共卫生与预防医学，2019年)。新地奥明(Neodiosmin)是从酸橙分离出来得到的一种黄酮类糖苷化合物，也可通过新橙皮苷(Neohesperidin)获取，具有较好的掩蔽苦味与调和产品风味的作用，在食品、饮料和药品的苦味抑制方面起着积极的作用(鲁明芳，新地奥明在抑制柑橘类果汁苦味中的应用，中国食品添加剂，2007年)。由于具有良好的应用前景使得黄酮类化合物在生产开发与设计方面也越来越受到重视，因此，如何大量制备这些黄酮类化合物也受到了越来越多的关注。黄酮类糖苷化合物的生物合成途径涉及多种酶，包括黄酮合成酶、羟基化酶、甲基化酶和一系列糖基转移酶，途径复杂，工业上难以应用。地奥司明在植物中含量低，工业上主要通过化学合成法来制备，主要有两种方法，一是橙皮苷(hesperidin)水氧化反应后水解成地奥司明，二是橙皮苷经碘取代反应后用吗啉脱碘反应生成地奥司明。近年来受资源供应制约、生产成本及环保等因素的影响，使用生物合成法生产黄酮类化合物得到越来越多的研究和发展。黄酮合酶(FNS)是存在植物中的一中双加氧酶，可以将低成本的黄烷酮化合物价值的黄酮化合物，例如将柚皮素转化为芹菜素。通过蛋白分子改造和定向进化筛选，使得黄酮合酶(FNS)可以将黄烷酮糖苷类化合物转化为黄酮糖苷类化合物，例如将橙皮苷转化为地奥司明，新橙皮苷转化为新地奥明。相比传统的化学合成法和植物提取法，具有低成本、周期短、环保和品质高等优势的细胞工厂，将具有更为广泛的应用前景。
技术实现思路
本技术公开的FNSI可实现包括地奥司明在内的多种黄酮糖苷类化合物的转化和制备。本专利技术公开的黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的多肽；或(b)将SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。优选地，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。本专利技术同时还公开了编码上述黄酮合酶的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，含有前述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。在本专利技术的另一方面，提供上述黄酮合酶的制备方法，其包括步骤：1)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；2)从培养物中分离出黄酮合酶。针对不同的宿主细胞可以分别进行表达工艺的优化，包括不同成分的培养基和培养条件，以及优化培养基的碳源、氮源和无机盐；优化培养时的温度、转速。制得的黄酮合酶可应用于将黄烷酮类糖苷化合物氧化脱氢转化为黄酮类糖苷化合物。具体是以α-酮戊二酸为辅因子，在pH＝5-9，温度20-45℃的条件下，将黄烷酮类糖苷化合物氧化脱氢转化为黄酮类糖苷化合物。例如，将橙皮苷转化为地奥司明。本专利技术公开的黄酮合酶具有FNSI的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。附图说明图1为黄酮合酶DcFNS和AgFNS琼脂糖凝胶电泳图；图2为大肠杆菌BL21表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS的Westernblot图；图3为黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷反应产物的HPLC检测图；图4为大肠杆菌BL21表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷效率比较图；图5为毕赤酵母菌GS115表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS的Westernblot图；图6为毕赤酵母菌GS115表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷效率比较图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。通过对多种植物的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中分别获得黄酮合酶的核苷酸候选序列DcFNS(SEQIDNO:3)和AgFNS(SEQIDNO:4)。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以α-酮戊二酸为辅因子，通过体外催化和全细胞催化检测其对橙皮苷的催化活性。本专利技术发现DcFNS和AgFNS表达产物能够高效催化橙皮苷合成具有高附加值和多种重要生理活性的地奥司明。实施例1.黄酮合酶DcFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达合成如序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。在紫外下照射，切下目标DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黄酮合酶，其特征在于，选自：/n(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或/n(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或/n(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.黄酮合酶，其特征在于，选自：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的多肽；或
(b)将SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。


2.根据权利要求1所述的黄酮合酶，其特征在于，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。


3.多核苷酸，其特征在于，选自：
(α)如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多核苷酸；或
(β)编码如权利要求1或2所述黄酮合酶的多核苷酸。


4.一种载体，其特征在于，含有如权利要求3所述的多核苷酸。


5.一种宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求4所述的载体或基因组中含有如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：周金林，周志华，叶德晓，王平平，严兴，
申请(专利权)人：佛山市汇腾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44