用于产生补身醇及其混合物的倍半萜合酶制造技术

本申请涉及一种通过使至少一种多肽与法呢基二磷酸酯(FPP)接触而产生补身醇和/或补身醇衍生物的方法。该方法可以在体外或体内进行。还提供了在该方法中有用的多肽的氨基酸序列和编码该多肽的核酸。该方法还提供了经遗传修饰以表达该多肽，并可用于产生补身醇和/或补身醇衍生物的宿主细胞或生物体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生补身醇及其混合物的倍半萜合酶
本文提供了产生补身醇和相关化合物和衍生物以及包含补身醇的混合物的生化方法，该方法包括使用新型多肽。
技术介绍
萜烯发现于大多数生物体(微生物、动物和植物)中。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元构成并且通过存在于它们结构中的这些单元的数目进行分类。因此，单萜、倍半萜和二萜是分别含有10、15和20个碳原子的萜烯。例如，在植物界中广泛地发现有倍半萜。许多倍半萜分子因为它们的风味和芳香特性以及它们的美容、医疗和抗菌效果而众所周知。已经鉴定出许多倍半萜烃和倍半萜类化合物。萜烯的生物合成产生涉及称为萜合酶的酶。在植物界中存在多种倍半萜合酶，它们均使用相同的底物(法呢基二磷酸酯，FPP)，但是具有不同的产品构造。已经克隆了编码倍半萜合酶的基因和cDNA并且表征了相应的重组酶。目前，补身醇的主要来源是天然含有补身醇的植物。但是，这些天然来源中的补身醇含量很低。已经开发了化学合成途径，但是仍然很复杂并且不具有成本效益。仍然需要发现新的萜烯、萜合酶以及从中产生补身醇及其衍生物和包含补身醇的混合物的更具成本效益的方法。
技术实现思路
本文提供了一种产生补身醇或包含补身醇的混合物的方法，包括：a.使无环法呢基二磷酸酯(FPP)前体与具有倍半萜合酶活性的多肽接触，以产生补身醇或包含补身醇与一种或多种萜烯的混合物，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；和b.任选地，分离补身醇。还提供了一种方法，该方法包括用编码具有补身醇合酶活性的多肽的核酸转化宿主细胞或非人宿主生物体，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:2。还提供了一种方法，其进一步包括在允许产生多肽的条件下，培养能够产生FPP并经转化以表达多肽的非人宿主生物体或宿主细胞，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个形态中，分离了由上述方法产生的补身醇。在另一形态中，该方法进一步包括使补身醇与至少一种酶接触以产生补身醇衍生物。在另一方面，该方法包括使用化学合成或生物化学合成将补身醇转化为补身醇衍生物。本文还提供了一种分离的多肽，其具有补身醇合酶活性，包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。本文进一步提供了一种分离的核酸分子，其包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有补身醇合酶活性，并且包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。还提供了一种分离的核酸，其包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的核苷酸序列。还提供了一种分离的核酸分子，其编码本文提供的多肽。本文提供的一个形态是一种载体，其包含本文所述的核酸分子。在另一形态中，该载体是表达载体。在另一形态中，该载体是原核载体、病毒载体或真核载体。还提供了非人宿主生物体或宿主细胞，其包含(1)上述核酸分子，或(2)包含所述核酸分子的表达载体。在一个形态中，非人生体物或宿主细胞是原核或真核细胞。在另一形态中，宿主细胞是细菌细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母。在另一形态中，细菌细胞是大肠杆菌，而酵母细胞是啤酒酵母。进一步提供了本文所述的多肽在产生补身醇或包含补身醇与一种或多种萜烯的混合物中的用途。在一个形态中，以上方法或用途中产生的混合物包含补身醇和橙花叔醇。在另一形态中，分离了补身醇和/或橙花叔醇。附图说明图1.(-)-补身醇的结构。图2.真实的(-)-补身醇的质谱图。图3.真实的(-)-补身醇的13CNMR谱。图4.真实的(-)-补身醇的X射线(CuKα辐射)结构。图5显示了窄叶芍药(Paeoniaanomala)根的二氯甲烷提取物的GC/MS色谱图。箭头表示补身醇的峰。图6.显示了PaTPS3的大肠杆菌表达实验的GC/MS色谱图(仅显示倍半萜区域)。图7.显示了图6中的补身醇峰的质谱图。图8.显示了PaTPS3体外测定的GC/MS色谱图(仅显示倍半萜区域)。图9.显示了图8中的补身醇峰的质谱图。具体实施方式使用的缩写bp碱基对kb千碱基DNA脱氧核糖核酸cDNA互补DNADTT二硫苏糖醇FPP法呢基二磷酸酯GC气相色谱IPTG异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷LB溶源性肉汤MS质谱/质谱法MVA甲羟戊酸PCR聚合酶链反应RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸miRNA微RNAsiRNA小干扰RNArRNA核糖体RNAtRNA转移RNA定义术语“多肽”是指连续聚合的氨基酸残基，例如至少15个残基，至少30个残基，至少50个残基的氨基酸序列。在本文的一些实施方案中，多肽包含作为酶、其片段或其变体的氨基酸序列。术语“蛋白”是指任何长度的氨基酸序列，其中氨基酸通过共价肽键连接，并且包括寡肽、肽、多肽和全长蛋白，不管天然生成的还是合成的。术语“分离的”多肽是指通过本领域已知的任何方法或这些方法(包括重组、生物化学和合成法)的组合从天然环境中取出的氨基酸序列。术语“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”涉及一种多肽，其能够从无环萜烯焦磷酸酯，尤其是法呢基二磷酸酯(FPP)开始，催化倍半萜或包含一种或多种倍半萜(例如补身醇和/或橙花叔醇)的混合物的合成。术语“补身醇合酶”或“具有补身醇合酶活性的多肽”或“补身醇合酶蛋白”涉及一种多肽，其能够从无环萜烯焦磷酸酯，尤其是法呢基二磷酸酯(FPP)开始，催化补身醇(非立体异构体或其混合物的形式)的合成。补身醇可以是唯一的产品，或者可以是倍半萜混合物的一部分。术语“生物学功能”，“功能”，“生物学活性”或“活性”是指补身醇合酶催化形成补身醇或包含补身醇与一种或多种萜烯的化合物混合物的能力。术语“包含补身醇的萜烯的混合物”或“包含补身醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生补身醇或包含补身醇的混合物的方法，包括：/na.使无环法呢基二磷酸酯(FPP)前体与具有倍半萜合酶活性的多肽接触，以产生补身醇或包含补身醇与一种或多种萜烯的混合物，其中该多肽包含与SEQ ID NO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和/nb.任选地，分离补身醇。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170607 EP 17174791.8;20170503 CN PCT/CN2017/08281.一种产生补身醇或包含补身醇的混合物的方法，包括：
a.使无环法呢基二磷酸酯(FPP)前体与具有倍半萜合酶活性的多肽接触，以产生补身醇或包含补身醇与一种或多种萜烯的混合物，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；和
b.任选地，分离补身醇。


2.根据权利要求1所述的方法，包括用编码具有补身醇合酶活性的多肽的核酸转化宿主细胞或非人宿主生物体，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:2。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在允许产生多肽的条件下，培养能够产生FPP并经转化以表达多肽的非人宿主生物体或宿主细胞，其中该多肽包含与SEQIDNO:2有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其包括使用化学合成或生物化学合成将补身醇转化为补身醇衍生物。


5.一种分离的多肽，其具有倍半萜合酶活性，包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：李攀，王祺，何绣峰，O·海弗里格，
申请(专利权)人：弗门尼舍有限公司，芬美意香料中国有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH