ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用制造技术

本发明专利技术涉及脱落酸（abscisic acid,ABA）8’‑羟化酶基因

Application of ABA 8 '- hydroxylase gene osaba8ox2 in plant photomorphogenesis and root development

【技术实现步骤摘要】
ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用
本专利技术涉及植物基因工程与遗传改良，具体涉及ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。
技术介绍
植物作为光合自养生物，对光环境是非常敏感和灵巧的。光形态建成和暗形态建成是植物采用的两套截然不同的发育程序以应对环境光线（Trendsinplantscience,Xuetal.2015）。中国西南部地区的四川和贵州等地几乎全年都处于弱光环境下（中国油料作物学报，范元芳等，2016）。黄淮海等地区持续或频繁的阴雨寡照天气对水稻、玉米等作物生产带来非常不利的影响。现代农业生产上采取的密植或间作套种会加剧作物群体对光的竞争。随着我国城市化进程的加快，很多土地因处于建筑包围之中而形成荫蔽的环境。总之，弱光照或遮荫条件影响非耐荫植物光形态建成，往往出现避荫反应（过度伸长生长，茎秆纤细，易倒伏等），影响植物生长、抗逆能力和最终品质和产量。因此开发提高植物耐荫性的方法具有巨大的应用价值。植物耐荫性是指植物在弱光照条件下的生活能力，是植物为适应低光量子密度，维持自身正常生长发育而产生的一系列变化（热带农业科学，安锋和林位夫，2005；安徽农业科学，代慧等，2015），是植物的一项重要性状。植物面对弱光和遮荫会采取两种应对策略：避荫反应和耐荫反应（分子植物育种，温冰消等，2019）。伸长反应是避荫反应的主要表现之一（CurrentOpinioninPlantBiology，Fraseretal.2016）。相比耐荫能力弱的植物，耐荫性强的植物伸长反应相对不明显。PIF（phytochrome-interactingfactor）蛋白促进伸长反应的机制之一是其介导了YUCCA基因上调表达（Genes&Development,Lietal.2012），提高生长素合成量。还存在避荫反应的拮抗因子，如PAR1和PAR2蛋白（TheEMBOJournal,Roig-Villanovaetal.2007）。除了利用耐荫基因，抑制避荫反应的调控途径可能是产生耐荫反应的另一机制（CurrentOpinioninPlantBiology，Vandenbusscheetal.2005）。下调/抑制避荫基因的功能是提高植物耐荫性的技术思路之一。当前研究主要聚焦于植物对光信号的响应，如光敏色素相互作用因子PIF通过光敏色素信号途径（phyB-PIF）响应不断变化的光环境（Plantphysiology,Wuetal.2019）。耐荫植物适应弱光环境的主要机制是最大化的吸收光量子进行光合作用（湖南林业科技，黄笛和吴铁明，2011）。光与ABA信号途径的交叉在拟南芥中已有报道。BBX21，一个B-box蛋白，调控光形态建成，也参与到ABA信号途径（PLoSgenetics,Xuetal.2014）。HY5是ABI5（ABAINSENSITIVE5）转录的直接激活子。BBX21通过干扰HY5与ABI5启动子的结合，负调控ABI5表达。ABA分解是调控植物体内ABA浓度的重要途径之一。ABA8’-羟化酶是ABA分解途径的关键酶，在水稻中由OsABA8ox1,OsABA8ox2和OsABA8ox3编码（Plant&cellphysiology,Saikaetal.2007）。我国对植物耐荫性的研究始于20世纪70年代，起步较晚（湖南林业科技，黄笛和吴铁明，2011）。目前对植物耐荫分子机制仍很不清楚，尤其缺乏对ABA分解途径关键基因参与光形态建成、避荫反应和耐荫调控的相关研究。随着世界气候变暖，极端天气条件越来越频繁出现，干旱是其中之一。干旱胁迫（水缺乏）会严重限制农业生产。水分可获取性对植物生存和充足生长起决定作用。根伸长生长到达更深土壤层以吸收足够的水分和营养对大部分植物的生存和生长至关重要。因此根系结构对植物生存至关重要。干旱耐受强的植物可以通过适当优化根系结构去适应缺水土壤环境。因此挖掘和应用重要的根系结构形成基因来增强作物干旱耐受，在极端天气越发频繁的趋势下，具有重要的价值。当光照不足时，植物变得细弱，叶片变长、变窄、变薄，向下输送的光合产物减少，影响根部生长，根系变浅（热带农业科学，安锋和林位夫，2005）。并在一定范围内，随着遮荫程度的加剧，根在全株总重中占比减少，而叶增加。因此正向调控弱光下的光形态建成，提高植物耐荫性，对植物根的生长和发育、根系结构优化是非常有益的。ABA处理24小时后显著增加了主根伸长率和根毛密度，而FLU（fluridone，氟啶草酮，ABA合成抑制剂）处理则是显著抑制（NewPhytologist,Xuetal.2013）。拟南芥ABA合成突变体aba3-1的主根伸长率和根毛密度与野生型相比是严重下降的，指出ABA对适度水胁迫下根尖响应的作用（NewPhytologist,Xuetal.2013）。与野生型水稻苗相比，OsABA8ox3RNA干扰（RNAi）转基因系在干旱胁迫耐受方面有很大提高（PLoSOne,Caietal.2015），但缺乏RNAi株系根发育和根系结构的研究结果。申请人的客座研究生韩璐的硕士学位论文（OsABA8ox2-RNAi转基因水稻鉴定及ABA相关基因表达分析，《中国优秀硕士学位论文全文数据库》基础科学辑，A006-307，20150115）指出对三叶期OsABA8ox2-RNAi转基因水稻用20%PEG6000处理后存活率显著高于野生型，但在方法中写到：“20%的PEG6000模拟干旱胁迫：20gPEG6000溶于1L的培养液。”。是20%PEG6000还是2%，存在疑问，并且也未对RNAi转基因水稻根发育和根系结构进行研究。通过RNAi技术下调基因表达和功能，其精准性和灵活性远远逊于目前火热发展的基因编辑技术。美国专利“CerealsWithAlteredDormancy”（专利号：US8269082B2；专利日期：2012年9月18日）公开了具ABA8’-羟化酶活性的多肽和编码这些蛋白的多核苷酸影响种子萌发率和休眠。综上，目前还没有OsABA8ox家族基因参与植物光形态建成和根发育的相关报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。本专利技术提供的技术方案是：通过失活植物体内ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2功能缓解植物避荫反应，提高耐荫性，优化干旱胁迫下根系结构。从OsABA8ox2编码序列（SEQIDNo：4）选取了一条19bp的特异编辑靶序列（SEQIDNo：6），利用T4DNALigase（NEB,Ipswich,MA,USA）构建敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2。通过农杆菌介导的转化获得了靶序列插入1个碱基和缺失2个碱基的水稻株系。突变的靶序列如SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示。OsABA8ox2编码序列（codingsequence,CDS）中靠近其5’端出现移码突变，突变后氨基酸序列如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示。所有的纯合O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ABA 8’-羟化酶基因

【技术特征摘要】
1.ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用，其特征是通过失活植物体内ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2功能正向调控植物光形态建成，缓解避荫反应，提高耐荫性，优化根系结构。


2.根据权利要求1所述ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用，其特征是，所用失活技术为基因编辑技术；编辑的基因为OsABA8ox2，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo：1所示；所述植物为禾本科作物水稻。


3.根据权利要求2所述ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用，其特征是，所述基因编辑的靶序列如序列表SEQIDNo：6所示，其突变序列如序列表SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示；突变氨基酸序列如序列表SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示。


4.OsABA8ox2启动子在根分生组织、颖花和灌浆期种子中的表达应用。


5.根据权利要求4所述OsABA8ox2启动子在根分生组织、颖花和灌浆期种子中的表达应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11