新型尼古丁降解酶变体制造技术

描述了相对于野生型NicA2和NOX酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。

Novel nicotine degrading enzyme variants

A nicotine degrading enzyme variant that exhibits increased nicotine degrading activity and / or reduced immunogenicity relative to the wild-type nica2 and NOx enzymes, a composition including the variant and a method of using the variant are described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型尼古丁降解酶变体相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年2月3日提交的美国临时申请第62/454,331号和2017年7月21日提交的美国临时申请第62/535,507号的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。
本公开总体上涉及治疗尼古丁成瘾或尼古丁中毒的领域。描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。
技术介绍
提供了以下讨论以帮助读者理解本公开，并且不承认以下讨论描述或构成其现有技术。吸烟是个全球性的医疗保健问题。世界卫生组织估计，全世界目前有13亿吸烟者，并且每年有近500万人的死与烟草有关。如果目前的吸烟模式继续下去，则到2020年每年因吸烟致死的人数将达到约1000万人。据美国疾病控制中心(CDC)称，在美国，烟草使用是唯一一个可预防的主要死因，每年造成约438,000人死亡。此外，据估计，吸烟每年导致的与健康相关的经济成本为约1570亿美元。CDC估计，美国4500万成年吸烟者中，70％的人想戒烟，但在12个月后，尝试戒烟的人中只有不到5％的人保持不吸烟。难以戒烟的一个原因是对香烟和其它烟草产品中的尼古丁成瘾。尼古丁是一种小分子，吸入体内后迅速进入血液并且随后横跨血脑屏障到达大脑。一旦进入大脑，尼古丁就会与尼古丁受体结合，这导致如多巴胺等兴奋剂的释放，从而激活犒赏系统(rewardsystem)并为吸烟者提供积极和愉悦的强化体验，由此导致成瘾。除了与吸烟和其它烟草使用相关的有害健康影响之外，由摄入或吸入过多尼古丁导致的尼古丁中毒是另一种与尼古丁相关的健康问题。尼古丁的LD50对于大鼠来说为50mg/kg，并且对于小鼠来说为3mg/kg。低至30-60mg(0.5-1.0mg/kg)的剂量对成年人类来说可能是致命的，而儿童在摄入一支香烟后可能生病，并且摄入超过这一数量可能导致儿童患重病。另一方面，一些证据表明，对于成年人来说，致死剂量可能高达500mg或更高(1.0-7.1mg/kg)。在任何一种情况下，急性尼古丁中毒通常发生在意外咀嚼尼古丁口香糖或贴片或摄入电子烟“电子液体”的儿童身上。在极少数情况下，还已经已知的是，儿童在摄入香烟后生病。仅在美国，每月报道的急性尼古丁中毒就达数百例。通常，尼古丁中毒的初始治疗可以包含施用活性炭以试图减少胃肠道吸收，而另外的治疗可以解决由尼古丁中毒引起的症状。已经提出使用野生型NicA2酶进行戒烟(参见，例如，Xue等人，《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》137:10136-39(2015))。然而，仍然需要用于治疗尼古丁成瘾的其它药剂、组合物和方法以及用于治疗尼古丁中毒的药剂、组合物和方法。
技术实现思路
本文描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。在一些实施例中，所述尼古丁降解酶变体包括作为SEQIDNO:1中所阐述的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中所述变体序列相对于SEQIDNO:1具有至少一个取代、添加或缺失，相对于所述野生型NicA2酶，所述取代、添加或缺失增加所述变体的尼古丁降解活性和/或降低其免疫原性。在一些实施例中，相对于所述野生型NicA2酶，所述变体表现出增加的尼古丁降解活性。在一些实施例中，野生型NicA2序列的变体包括不同位置处的取代AF104L、G106S、A107H、A107P、107R、A107K、A107T、F355C、F355V、W427Q、W427E、W427S、W427M、W427H、W427L、W427R、R91A、R91Q、R91F、R91G、R91T、R91L、R91S、R91N、T250G、T250L、T250R、T250V、T250P、K340P、K340I、K340V、K340D、K340E、Q366K、Q366E、Q366V、Q366L、Q366I、Q366Y、T381P、T381I、T381V、T381Q、T381N、T381L、T381M、N462L、N462Y、N462S、N462F、N462G、N462E、N462A、N462M、I463F、I463Y、I463A、I463V、I463L、L217Q、L217G、L217E、L217I、L217C、或L217S或其中任何两个或更多个。在一些实施例中，所述变体序列包括选自SEQIDNO:5-56中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述变体的所述尼古丁降解活性是所述野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少200％、至少300％或至少400％。在一些实施例中，所述变体序列包括SEQIDNO:1的氨基酸位置91、104、106、107、217、250、340、355、366、381、427、462或463处的至少一个、至少两个或至少三个取代。在一些实施例中，所述变体可以具有肽的N端处的1-52个氨基酸的缺失。例如，衍生自SEQIDNO:1的变体可以包括来自肽的N端的5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、51个或52个氨基酸的缺失。在一些实施例中，另外地或可替代地，所述变体可以具有来自肽的C端的1个或多个氨基酸的缺失，如C端残基的缺失。另外地或可替代地，在一些实施例中，相对于所述野生型NicA2酶，所述NicA2变体表现出降低的免疫原性。在一些实施例中，相对于所述野生型NicA2酶，所述免疫原性降低75％或更多。在一些实施例中，所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的氨基酸10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391或435-459的区域内的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。在一些实施例中，所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的氨基酸16-24、73-81、258-266、302-310、373-381或447-455的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。在一些实施例中，所述变体序列包括选自以下的位置处的至少一个取代、添加或缺失：(a)SEQIDNO:1的氨基酸残基74、77、78或80；(b)SEQIDNO:1的氨基酸残基262、263、264或266；(c)SEQIDNO:1的氨基酸残基303、304、306或310；(d)SEQIDNO:1的氨基酸残基374、377、378、382或383；和/或(e)SEQIDNO:1的氨基酸残基450、451、452或457。在一些实施例中，所述变体序列包括至少一个选自表3中针对表位B所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述变体序列包括至少一个选自表3中针对表位1所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述变体序列包括至少一个选自表3中针对表位2所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述变体序列包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尼古丁降解酶变体，其包括作为SEQ ID NO:1中所阐述的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中所述变体序列相对于SEQ ID NO:1具有至少一个取代、添加或缺失，相对于所述野生型NicA2酶，所述取代、添加或缺失增加所述变体的尼古丁降解活性和/或降低其免疫原性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170203 US 62/454,331;20170721 US 62/535,5071.一种尼古丁降解酶变体，其包括作为SEQIDNO:1中所阐述的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中所述变体序列相对于SEQIDNO:1具有至少一个取代、添加或缺失，相对于所述野生型NicA2酶，所述取代、添加或缺失增加所述变体的尼古丁降解活性和/或降低其免疫原性。


2.根据权利要求1所述的变体，其中相对于所述野生型NicA2酶，所述变体表现出增加的尼古丁降解活性。


3.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括取代W427R、W427H、W427L、W427Q、W427E、W427S或W427M。


4.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:135的氨基酸序列。


5.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的91、104、106、107、217、250、340、355、366、381、427、462和463的氨基酸位置处的至少一个取代。


6.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的91、104、106、107、217、250、340、355、366、381、427、462和463的两个或更多个氨基酸位置处的至少两个取代。


7.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的91、104、106、107、217、250、340、355、366、381、427、462和463的三个或更多个氨基酸位置处的至少三个取代。


8.根据权利要求5到7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包括选自SEQIDNO:1的74、77、78、80、262-266、303、304、306、310、374、377、378、382、383、450-452和457的氨基酸位置处的至少一个取代。


9.根据权利要求8所述的变体，其中所述变体包括氨基酸位置262或263处的取代。


10.根据权利要求8所述的变体，其中所述变体包括氨基酸位置262和263处的取代。


11.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自R91A、R91Q、R91F、R91G、R91T、R91L、R91S和R91N的取代。


12.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:129的氨基酸序列。


13.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自T250P、T250G、T250L、T250R和T250V的取代。


14.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:136的氨基酸序列。


15.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自K340P、K340I、K340V、K340D和K340E的取代。


16.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25的氨基酸序列。


17.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自Q366K、Q366E、Q366V、Q366L、Q366I和Q366Y的取代。


18.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:130的氨基酸序列。


19.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自T381P、T381I、T381V、T381Q、T381N、T381L和T381M的取代。


20.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:131的氨基酸序列。


21.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自N462M、N462L、N462Y、N462S、N462F、N462G、N462E和N462A的取代。


22.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:132和SEQIDNO:133的氨基酸序列。


23.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自I463F、I463Y、I463A、I463V和I463L的取代。


24.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的氨基酸序列。


25.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自L217Q、L217G、L217E、L217I、L217C和L217S的取代。


26.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的氨基酸序列。


27.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自A107H、A107P、A107R、A107K和A107T的取代。


28.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:124、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:134、SEQIDNO:142和SEQIDNO:143的氨基酸序列。


29.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自F355C和F355V的取代。


30.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:127和SEQIDNO:128的氨基酸序列。


31.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自以下的取代：(i)W427Q和I262A；(ii)W427Q、I262T和N263R；(iii)W427H和N462F；以及(iv)W427L和N462M。


32.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:137和SEQIDNO:138的氨基酸序列。


33.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自F104L的取代。


34.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括SEQIDNO:140。


35.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括选自G106S的取代。


36.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体序列包括SEQIDNO:141。


37.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体的所述尼古丁降解活性是所述野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少300％。


38.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体的所述尼古丁降解活性是所述野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少400％。


39.根据权利要求2所述的变体，其中所述变体的所述尼古丁降解活性是所述野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少200％。


40.根据权利要求1到39中任一项所述的变体，其中相对于所述野生型NicA2酶，所述变体表现出降低的免疫原性。


41.根据权利要求40所述的变体，其中相对于所述野生型NicA2酶，所述免疫原性降低75％或更多。


42.根据权利要求40或41所述的变体，其中所述变体序列包括选自SEQIDNO:1的氨基酸10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391和435-459的区域内的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·W·卡尼克，托马斯·齐斯泰兹，埃弗雷特·斯通，查尔斯·C·里德，马克斯·罗德尼克·史密斯，
申请(专利权)人：安蒂多特疗法公司，得克萨斯州大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US