一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用，属于基因工程领域。所述酶的活性在纤维素的结晶多糖降解中提供降解功能。本发明专利技术所述裂解性多糖单加氧酶突变体，是由野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，发生第34位由Arg突变为Leu，该突变酶和野生酶的最适温度都为85℃，突变酶的比活力比野生酶显著提高2倍左右，且在pH大于5.5时，突变酶的比活力较野生酶显著高出2倍左右。以微晶纤维素为底物时，纤维素酶与突变酶的协同反应所产葡萄糖含量较以纤维素酶单独降解底物显著提高了48.5％，可以看出突变酶显著提高了酶活力，可以降低工业应用的经济成本。

A modified lysopolysaccharide monooxygenase with site directed mutagenesis and its construction and Application

The invention discloses a point mutation modified lysopolysaccharide monooxygenase and a construction method and application thereof, belonging to the field of genetic engineering. The activity of the enzyme provides a degradation function in the degradation of crystalline polysaccharides of cellulose. The lysosomal monooxygenase mutant of the invention is based on the amino acid sequence of lysosomal monooxygenase of wild-type thermophilic Fusarium, the 34th mutation occurs from Arg to Leu, the optimum temperature of the mutant enzyme and wild-type enzyme is 85 \u2103, the specific activity of the mutant enzyme is about 2 times higher than that of the wild-type enzyme, and the specific activity of the mutant enzyme is significantly higher than that of the wild-type enzyme when the pH is greater than 5.5 About two times higher. When microcrystalline cellulose was used as substrate, the content of glucose produced by the synergistic reaction of cellulase and mutant enzyme was significantly increased by 48.5% compared with that of the substrate degraded by cellulase alone. It can be seen that the mutant enzyme significantly increased the enzyme activity and reduced the economic cost of industrial application.

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种定点突变方法制备裂解性多糖单加氧酶突变体。
技术介绍
虽然我国已经成为世界第二大经济体，但是依然面临着能源、资源和环境的挑战。石油资源面临枯竭，寻求可替代能源的再生资源急不可耐。生物乙醇是可再生且碳中性的生物液体燃料，可以缓解能源紧张的问题。所以从生物质提取乙醇一直是政府支持的重点。第一代从淀粉或糖中提取的生物燃料已经是一种成熟的技术，但由于它们对食物资源的依赖，加上缺乏足够的资源来满足未来的能源需求，所以意味着需要寻找替代能源。因此，从不可食用的木本植物中得到第二代生物燃料被认为是至关重要的。这种顽固材料主要由木质纤维素组成，包括纤维素、半纤维素和木质素，是地球上最丰富的生物聚合物。但是目前此类聚合物没有得到充分的利用，因此合理的利用这类资源将会对能源危机的缓解至关重要。纤维素是木质纤维素中含量最丰富的组分，其降解后的组分单糖是发酵生成乙醇的主要成份。纤维素中的多糖主要是结晶多糖的形式存在，目前的纤维素酶对于降解此类结晶多糖的效率很低，因此时间和经济成本较高，限制了此类物质的再利用。最近发现的裂解性多糖单加氧酶(LyticPolysaccharideMonooxygenases：LPMOs)的发现改变了这一现状，其作用于结晶多糖时，不仅能结合于多糖表面，还能通过氧化作用的方式断裂多糖的糖苷键，使得多糖的结构趋于松散，为之后酶的水解提供基础。然后再通过发酵生成生物乙醇，它开辟了采用可持续原料生产生物乙醇的新的可能性。LPMOs是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶，常具有多种模块化组合，能够高效氧化降解生物质多糖。近年来的研究表明，在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率，因此高催化活性LPMOs的研发可以降低工业规模的生产成本，提高经济效益。定点突变技术是在已知的核苷酸序列中准确改变一个或多个碱基，从而改变组成蛋白质的一个或多个氨基酸残基，以研究蛋白质结构和功能的关系。近年来，定点突变技术在基因工程改造中发挥着巨大作用，在提高酶活，改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在LPMOs的改造中还应用较少，尤其对于真菌LPMOs，鲜有定点突变改造的文献报道。因此，定点突变改造真菌LPMOs的研究具有极佳的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用定点突变的方法对真菌来源的裂解性多糖单加氧酶进行改造，获得酶活性提高的裂解性多糖单加氧酶突变体，降低工业应用的经济成本。本专利技术所述裂解性多糖单加氧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQIDNo.3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。所述裂解性多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNo.1。编码权利要求1所述突变体的基因。优选地，所述编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述裂解性多糖单加氧酶突变体的用途，在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，所述突变体的酶活是野生型的1.88倍。一种重组载体，含有所述突变体的编码基因。一种宿主细胞，其特征在于含有权5所述重组载体或权利要求1所述突变体的编码基因。优选地，所述重组载体为pPIC9K-MtLPMO9A-R34L，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。一种获得所述裂解性多糖单加氧酶突变体的方法，步骤如下：(1)构建包含所述裂解性多糖单加氧酶的编码基因的重组载体，所述重组载体以大肠杆菌为宿主；(2)以所述步骤(1)中的重组载体为模板，利用如SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示的引物对，通过反向PCR扩增得到包含有SEQIDNo.2所示的碱基序列的PCR产物，之后同时对PCR产物进行磷酸化反应和连接，自身环化成环状质粒；(3)将所述步骤(2)得到的环状质粒转化入大肠杆菌中培养，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的重组载体；(4)将所述步骤(3)中的重组载体转化至宿主细胞即毕赤酵母的感受态细胞中，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变基因工程菌。优选地，所述步骤(1)中，裂解性多糖单加氧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。优选地，所述步骤(2)中，反向PCR扩增过程中通过利用KOD-Plus-MutagenesisKit试剂盒进行。优选地，所述步骤(2)中，所述PCR产物进行磷酸化反应和连接过程中，所用酶为T4多聚磷酸激酶和Ligationhigh连接酶。有益效果相比野生酶，本专利技术的突变酶的酶活力提高2倍左右，酶活力的提高可以有效的降低工业应用的经济成本。在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，以2,6-二甲氧基苯酚为底物测定酶活力，野生酶的比活力为174.8U/g，突变酶的比活力为327.8U/g。以微晶纤维素为底物，相比纤维素酶单独作用时，纤维素酶与野生酶协同作用时，葡萄糖含量提高了23.9％，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量提高了48.5％，其提高量是纤维素酶与野生酶协同作用所产葡萄糖提高量的2.03倍。附图说明图1为野生酶与突变酶的转化子的PCR验证，其中M:1kbMarker；1:野生酶的转化子；2:突变酶的转化子；图2为野生酶与突变酶在pH7.5，不同温度条件下测定酶活力；图3为野生酶与突变酶在温度85℃，不同pH条件下测定酶活力；图4为降解微晶纤维素产生的葡萄糖含量。具体实施方式实施例1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的制备(1)构建重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A：编码野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶(氨基酸序列SEQIDNo.3所示)的基因的重组载体。首先根据原始氨基酸序列(GenBank:AKO82493.1)以酵母表达宿主进行密码子优化合成基因，得到经优化后的裂解性多糖单加氧酶编码基因(核苷酸序列如SEQIDNo.4)，将上述裂解性多糖单加氧酶编码基因和pPIC9K载体分别使用BamHI和EcoRI酶进行双酶切，然后分别进行回收，用连接酶将回收后的编码基因片段与pPIC9K载体进行连接，得到重组载体pPIC9K-MtLPMO9A，将重组载体pPIC9K-MtLPMO9A化转至克隆宿主E.coliJm109，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQIDNo.4相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组载体pPIC9K-MtLPMO9A。(2)构建重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A-R34L：含有裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的重组载体。以重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对(如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示)，利用KOD-Plus-MutagenesisKit试剂盒反向PCR扩增得到包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列是在如SEQID No.3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。/n

【技术特征摘要】
1.一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列是在如SEQIDNo.3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。


2.编码权利要求1所述突变体的基因。


3.如权利要求2所述一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于：所述编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的用途，在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，所述突变体的酶活是野生型的1.88倍。


5.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述突变体的编码基因。


6.一种宿主细胞，其特征在于含有权5所述重组载体或权利要求1所述突变体的编码基因。


7.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pP...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘夫锋，郭宵，安亚静，柴成程，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12