用于iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟的方法和系统技术方案

本发明专利技术为诱导未成熟心肌细胞功能成熟的方法，所述未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)，所述方法为通过根据诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上的成体心肌细胞时为止。

Methods and systems for functional maturation of cardiomyocytes derived from IPSC and ESC

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求于2017年3月3日提交的美国临时专利申请no.62/466,992和2017年4月26日提交的美国临时专利申请no.62/490,505的优先权权益，将其各自的全部内容通过提述完整并入本文。
本专利技术涉及将iPSC和ESC衍生的心肌细胞以电方式诱导成具有成体样表型的细胞并且以电方式监测该成熟过程的方法。专利技术背景诱导多能干细胞(iPSC)是一种可以直接从成体细胞生成的多能干细胞。这项技术是在十年前通过在胚胎干(ES)细胞培养条件下将编码转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的四个特定基因引入到小鼠成体成纤维细胞中而开创的。Takahashi等人(2006)。Takahashi等人后来证明其因子也对人类起作用。Takahashi等人(2007)。iPSC的使用在再生医学应用以及药物发现和开发方面前景广阔。具体而言，iPSC可以分化成用于潜在疗法的许多不同类型的细胞，比如神经元、心肌细胞和肝细胞。这些细胞还可以用于了解潜在的疾病机制和筛选可用于减轻疾病状况的治疗剂。源自iPSC技术的首批细胞类型之一是心肌细胞。这些源自iPSC的心肌细胞显得表达适当的离子通道库以及在正常心肌细胞中发现的结构蛋白和其他蛋白质。然而，使iPSC完全分化成具有成体表型的心肌细胞是具有挑战性的。相反，其发育通常在未成熟阶段停滞，与成熟或成体表型相比，不成熟心肌细胞趋于具有圆形的形态，肌节紊乱，缺乏T管，基因表达谱不同，并且动作电位分布不同。不成熟的心肌细胞作为治疗途径的潜力是有限的。Yang等人(2014)。已采用多种不同的途径来改善iPSC衍生心肌细胞的成熟状态，包括长期心肌细胞培养(Lundy等人，2013)，在劲度接近天然心肌的基底上培养细胞(Jacot等人，2008)，将细胞接种到提供拓扑线索的图案化基底上(McDevitt等人，2002)，对细胞施加机械负载(Zimmermann等人，2002)，以及定向电刺激(Sathaye等人，2006)。所有这些方法都可以导致心肌细胞在结构和功能上类似于成体样表型。但是，每个系统都有其弱点，例如难以实现高通量筛选，且需要高水平的技术知识。因此，仍然需要用于使心肌细胞前体细胞(包括iPSC衍生的和胚胎干细胞(ESC)衍生的心肌细胞)进一步成熟为具有成熟表型或成体样表型的心肌细胞的改进的系统和方法。专利技术简述本专利技术解决了上述不足并提供了相关益处。具体而言，本专利技术提供了以电方式诱导iPSC或ESC衍生的心肌细胞进一步成熟并且以电方式监测其成熟为更像成体样的表型的方法和系统。这至少部分地是通过扩展由ACEABiosciences公司(SanDiego,CA)开发的xCELLigenceCardioECR系统的电起搏和监测特征来实现的，上述系统使用专门开发的诱导成熟的脉冲谱系统地使iPSC和其他未成熟心肌细胞起搏(pace)，同时还监测培养细胞的搏动谱，以监测成熟过程。更具体地说，在本专利技术的一个方面，提供了一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：提供系统，该系统被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动；在所述系统中培养未成熟心肌细胞；监测未成熟心肌细胞以将该心肌细胞搏动表征为同步的或不同步的；并且，如果是同步的，则按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体性的(functionallyadult)心肌细胞时为止。在一些实施方案中，所述系统包括位于基底上并且与阻抗分析器可操作连接的阻抗监测电极阵列，用于监测系统中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。在其他实施方案中，所述系统包括与细胞外记录放大器可操作连接的细胞外记录电极阵列，用于对系统中培养的细胞群体进行细胞外记录。在其他实施方案中，通过提供上述二者，诸如基底上的阻抗监测电极阵列、基底上的细胞外记录电极阵列、阻抗分析器和细胞外记录放大器，系统被配置为监测细胞-基底阻抗并对系统中培养的细胞群进行细胞外记录。在一些实施方案中，细胞-基底阻抗监测电极阵列与细胞外记录电极阵列之间共享电极，但在其他实施方案中，各阵列各自具有其自己独特的电极对。提供的改进之处包括能够使心肌细胞从不同的未成熟水平或程度开始分化，而无需考虑培养中的搏动速率。换言之，本申请中的方法可用于诱导以特征为负性力-频率关系为特征的被视为未成熟的任何心肌细胞群的成熟。为此，被表征为未成熟的(在本文中也称为具有胚胎表型的)心肌细胞，只要经历兴奋-收缩偶联，就可以使用。这样，未成熟心肌细胞可衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。此外，可以对未成熟心肌细胞进行电监测，以将其阶段表征为未成熟或成体，并评估其是否适合经历进一步分化。其中，监测心肌细胞成熟的有用手段包括监测心肌细胞的细胞-基底阻抗。在其他实施方案中，通过心肌细胞的细胞外记录来对未成熟心肌细胞进行电监测。在一种混合手段中，通过心肌细胞的细胞-基底阻抗监测和心肌细胞的细胞外记录对未成熟心肌细胞进行电监测。心肌细胞搏动的电测量使得确定力-频率关系成为可能，其中，正性的力-频率关系指示成熟心肌细胞群，而负性的力-频率关系指示未成熟心肌细胞群。另外，可以利用未成熟心肌细胞的电监测来确定心肌细胞搏动是否同步，例如通过确定未成熟心肌细胞的搏动速率并随时间比较该搏动速率。如果心肌细胞搏动不同步，则未成熟心肌细胞可能需要额外的培养。还可利用未成熟心肌细胞的电起搏来诱导未成熟心肌细胞的同步搏动。可以通过以恒定频率施加电脉冲来实现电诱导同步搏动。具体而言，通常以与未成熟细胞的搏动速率相同的速率或大约相同的速率提供电脉冲。通常，约0.5Hz至1Hz的脉冲频率可以帮助同步化搏动。一旦搏动同步化，即按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，以诱导进一步成熟为功能上成熟或成体表型。这些脉冲谱是为了诱导iPSC衍生的心肌细胞、ESC衍生的心肌细胞和功能不成熟的心肌细胞成熟而建立的。一种示例性的脉冲谱具有矩形脉冲形状。一种示例性脉冲强度为0.7V至1V，且高达几伏(例如2V或3V)的强度或电压是可接受的。脉冲强度应该高至足以使未成熟心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会导致装置中的心肌细胞的搏动周期)。示例性脉冲谱具有0.1毫秒至0.2毫秒的脉冲持续时间或宽度，其中高达10毫秒的持续时间是可接受的。在适当施加脉冲强度的情况下，脉冲持续时间应该足够长，以使心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会促成装置中的心肌细胞的搏动周期)。通常，应该施加尽可能短的脉冲持续时间，只要它促成心肌细胞的有效起搏即可(即，每个施加的脉冲都会促成孔中的心肌细胞的搏动周期)。使用所述系统使未成熟心肌细胞分化主要是通过施加具有变化的脉冲频率的脉冲谱使未成熟心肌细胞随时间推移起搏来完成的。技术人员将理解，脉冲谱可以根据未成熟心肌细胞的搏动速率而变化，并且还可以根据所使用的使未成熟心肌细胞分化为成熟心肌细胞的方法而变化。作为示例，脉冲谱将典型地以与未成熟心肌细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：/na)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；/nb)在该系统中培养未成熟心肌细胞；/nc)监测未成熟心肌细胞，以将心肌细胞搏动表征为同步或不同步；和/nd)如果是同步的，则按照诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体的心肌细胞为止。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170303 US 62/466,992;20170426 US 62/490,5051.一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：
a)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
b)在该系统中培养未成熟心肌细胞；
c)监测未成熟心肌细胞，以将心肌细胞搏动表征为同步或不同步；和
d)如果是同步的，则按照诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体的心肌细胞为止。


2.权利要求1的方法，其中所述系统包括细胞-基底阻抗监测电极阵列，所述阵列位于基底上并且与阻抗分析器可操作连接，用于监测该系统中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。


3.权利要求1的方法，其中所述系统包括细胞外记录电极阵列，所述阵列与细胞外记录放大器可操作连接，用于对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。


4.权利要求1的方法，其中所述系统包括基底上的细胞-基底阻抗监测电极阵列、基底上的细胞外记录电极阵列、阻抗分析器和细胞外记录放大器，其中所述系统被配置为监测细胞-基底阻抗并对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。


5.权利要求1的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。


6.权利要求1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括监测未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗。


7.权利要求1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括对未成熟心肌细胞进行细胞外记录。


8.权利要求1的方法，其中表征心肌细胞搏动是否同步是通过确定未成熟心肌细胞的搏动速率并随时间比较该搏动速率来进行的。


9.权利要求1的方法，其中如果心肌细胞搏动不同步，则所述方法进一步包括使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。


10.权利要求9的方法，其中使搏动同步的电起搏是在恒定频率下的。


11.权利要求1的方法，其中脉冲谱包括矩形脉冲形状。


12.权利要求1的方法，其中脉冲谱包括0.7V至1V的脉冲强度。


13.权利要求1的方法，其中脉冲谱包括从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。


14.权利要求1的方法，其中脉冲谱包括1Hz至2Hz之间的脉冲频率。


15.权利要求1的方法，其中脉冲谱包括随时间增加的脉冲频率。


16.权利要求15的方法，其中所述增加的脉冲频率历时几天到几周增加。


17.权利要求15的方法，其中所述增加的脉冲频率随着时间推移频率加倍。


18.权利要求15的方法，其中所述增加的脉冲频率从0.75Hz增加到2Hz。


19.权利要求1的方法，其中所述功能上成体的或成熟心肌细胞包括正性搏动力-频率关系，而未成熟心肌细胞包括负性搏动力-频率关系。


20.权利要求1的方法，其中使未成熟心肌细胞起搏直到其显示出正性搏动力-频率关系为止。


21.一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：
a)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
b)在该系统中培养未成熟心肌细胞；
c)按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞功能成熟为止；
d)向功能成熟的心肌细胞添加疑似对心肌细胞搏动力或心肌细胞搏动速率有作用的化合物；
e)在添加化合物之前和之后对培养心肌细胞进行电监测；
f)确定在添加化合物之前和之后的至少一个表征搏动力或搏动速率的参数；
g)比较在添加化合物之前和之后确定的至少一个参数，由此鉴定响应于添加化合物的差异；并且
h)将所述化合物表征为：
如果在添加化合物之后搏动力增加，则为正性肌力化合物，或者如果在添加化合物之后搏动力降低，则为负性肌力化合物，和/或
如果在添加化合物之后搏动速率增加，则为正性变时性化合物，或者如果在添加化合物之后搏动速率降低，则为负性变时性化合物。


22.权利要求21的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。


23.权利要求21的方法，其中培养所述未成熟心肌细胞直到搏动同步为止。


24.权利要求23的方法，其中通过电测量来确定同步搏动。


25.权利要求24的方法，其中所述电测量选自下组：细胞-基底阻抗监测、细胞外记录、细胞-基底阻抗监测与细胞外记录。


26.权利要求23的方法，其中如果搏动不同步，则所述方法进一步包括使心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。


27.权利要求21的方法，其中使心肌细胞起搏直到显示出正性搏动力-频率关系为止。


28.权利要求21的方法，其中脉冲谱包括矩形脉冲形状。


29.权利要求21的方法，其中脉冲谱包括0.7V至1V的强度。


30.权利要求21的方法，其中脉冲谱包括从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。


31.权利要求21的方法，其中脉冲谱包括1Hz至2Hz之间的脉冲频率。


32.权利要求21的方法，其中脉冲谱包括随时间增加的脉冲频率。


33.权利要求32的方法，其中所述增加的脉冲频率历时几天到几周增加。


34.权利要求33的方法，其中所述增加...

【专利技术属性】
技术研发人员：X·张，Y·A·阿巴西，李楠，王小波，
申请(专利权)人：美国艾森生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US