一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统，包括远红光调控基因表达环路控制系统以及基因定位器。本发明专利技术还提供了一种远红光调控的诱导干细胞分化的方法，所述远红光调控的诱导干细胞分化的方法能够高效将诱导性多功能干细胞(iPSCs)分化为成熟的神经细胞。本发明专利技术方法可以通过远红光诱导干细胞分化，本发明专利技术具有无毒性、高效性、绝缘性以及灵活性诱导干细胞分化的特点，在细胞治疗以及再生医学领域中具有巨大的潜在应用价值。

A system of inducing stem cell differentiation regulated by far red light and its application

The invention discloses a system for inducing stem cell differentiation regulated by far red light, including a control system of far red light regulated gene expression loop and a gene locator. The invention also provides a method for inducing stem cell differentiation regulated by far red light, and the method can effectively differentiate the induced multifunctional stem cells (iPSCs) into mature neural cells. The method of the invention can induce stem cell differentiation by far red light, which has the characteristics of non toxicity, high efficiency, insulation and flexibility, and has great potential application value in the field of cell therapy and regenerative medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统及应用
本专利技术涉及合成生物学、光遗传学、干细胞等多学科交叉领域，具体涉及一种远红光调控的诱导干细胞分化的方法，高效诱导干细胞分化，以及其在干细胞分化研究中的应用。
技术介绍
诱导性多能干细胞(iPSCs)是生命科学的一个重大进展，解决了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题，能够自我更新并维持未分化的状态，其在体外可以定向诱导成多种体细胞，无论在理论研究还是临床应用上都具有巨大的应用价值。诱导iPSCs分化为不同的体细胞在疾病模型与机制的研究中具有重大的意义。目前，虽然诱导干细胞分化成体细胞已经有较多报道和研究，然而调控诱导干细胞分化成体细胞的研究还有待进一步改进，比如诱导条件的安全无毒性、空间特异性、灵活调控性、诱导的高效性等都是有待改进的问题。远红光是一种理想的基因表达诱导物。具有易获得性，时空特异性，安全无毒性，对细胞刺激性小。因此利用远红光作为诱导剂来调控干细胞分化以及在干细胞的研究有极大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术首次将光遗传学、基因编辑技术和再生医学进行有机结合，提出一种远红光调控的诱导干细胞分化的方法，诱导iPSCs分化为体细胞，本专利技术能够通过远红光激活任意外源和内源基因，并能够诱导干细胞分化成成熟细胞。本专利技术具有正交性良好、稳定性高、诱导效率高以及无毒副作用等特点，在哺乳动物基因工程精准地时空调控体细胞行为以及干细胞的研究中具有巨大的潜在应用价值。本专利技术首次提出了一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统，所述系统包括远红光调控基因表达环路控制系统(FACE系统)和基因定位器。其中，所述远红光调控基因表达环路控制系统(FACE系统)可以将诱导性多能干细胞高效分化为成熟的神经细胞，为干细胞分化提供了新的工具，可用于相关的疾病的研究和治疗，具有极大的潜在应用价值。其中，所述远红光调控系统(FACE系统)能够高效地诱导内源基因的转录表达，包括细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS、c-di-GMP的降解酶YhjH、BldD融合表达的激活子p65-VP64-BldD、BldD识别结合的启动子PFRL1b[(whiG)2-PhCMVmin3G]，序列如SEQIDNO.1-4所示。其中，所述基因定位器能够有效靶向到目标基因的启动子位置，包括dCas9蛋白以及具有指导靶向目的基因作用的所有单链RNA(sgRNA)，dCas9氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。单链RNA的序列选自序列6,7(SEQIDNO.6，7)等所有基因组匹配序列。所述dCas9蛋白可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因位点配对，启动任意外源基因的表达。进一步，所述dCas9蛋白还可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因启动子位点配对，启动体内外任意内源基因的表达；其中，所述体内任意内源基因包括体内肌肉相关的内源基因。本专利技术中所述的各核苷酸序列或氨基酸序列均可采用人工合成的方法制备。本专利技术提出了一种人工设计、合成的远红光调控的诱导干细胞分化的方法。所述方法包括以下步骤：(1)接种细胞将生长状态良好的iPSCs细胞接种于24孔培养板中，所述培养板中的培养基为含有15％胎牛血清、1％非必需氨基酸的GMEM培养基。；进一步，所述培养基还包括浓度为10-3M的谷氨酰胺、浓度为10-3M的β‐巯基乙醇、活力为1000U/mL的重组小鼠白血病抑制因子，所述培养基需每天更换。(2)稳转株生产将远红光调控基因表达环路控制系统(FACE系统)，SleepingBeauty转座酶表达载体电转iPSCs细胞；随后，将所述iPSCs细胞接种于24孔板中，用嘌呤霉素和抗菌素筛选出稳定表达远红光调控基因表达环路控制系统的iPSCs细胞。其中，所述FACE系统为pWS287(ITR-PhCMV-p65-VP64-BldD-pA:PhCMV-BphS-pA:PmPGK-PuroR-pA-ITR)、pWS289(ITR-PFRL1b-FGTA4-pA:PmPGK-ZeoR-pA-ITR；PFRL1b,pA-(whiG)3-PhCMVmin；FGTA4,MS2-P65-HSF1-ITR)；所述SleepingBeauty转座酶表达载体为pCMV-T7-SB100(PhCMV-SB100X-pA)。(3)病毒感染将含有dCas9的慢病毒以及靶向分化成神经元的相关内源基因NEUROG2的sgRNA，pWS74(LTR-PU6-sgRNA1(NEUROG2)-LTR)和pWS76(LTR-PU6-sgRNA2(NEUROG2)-LTR)]感染所述的稳定表达远红光调控基因表达环路控制系统(FACE系统)的iPSCs细胞，每天更换无LIF的GMEM培养基，并在远红光照射6h/d。其中，所述含有dCas9的慢病毒为pXS187(LTR-PEF1a-dCas9-p2A-Blast-LTR)。(4)诱导分化第五天在培养基中加入5×10-7M的反式RA，第八天后可以得到分化的神经细胞。本专利技术远红光调控的诱导干细胞分化的方法的作用机理为，细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS当在远红光照射条件下产生c-di-GMP时，c-di-GMP与BldD结合使其形成二聚体，诱导转录表达下游与dCas9融合的转录激活子，从而激活特定转录因子，诱导干细胞定向分化。当光照停止不能产生c-di-GMP时，已合成的c-di-GMP被降解，BldD无法形成二聚体，则无法表达dCas9融合的转录激活子，无法激活目的转录因子，干细胞不能进行分化。本专利技术还提供了远红光调控的诱导干细胞分化的方法的真核表达载体、工程化细胞。本专利技术还提出了制备含有所述远红光调控的诱导干细胞分化的方法的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体的方法。其中，所述真核表达载体包括含有所述远红光调控的诱导干细胞分化的方法的哺乳类动物细胞表达载体。所述表达载体可以是单独含有远红光调控的方法编码基因的载体或单独基因定位器编码基因的载体或两者都有，前述所有的哺乳类动物细胞表达载体的构建方式详见表1。本专利技术还提供了远红光调控的诱导干细胞分化的系统的构建方法，具体包括以下步骤：(1)构建远红光调控基因表达环路控制系统。其中，远红光调控基因表达环路控制系统包括远红光感受蛋白Bphs，氨基酸序列如SEQIDNO.1，响应c-di-GMP的融合蛋白p65-VP64-BldD，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，以及启动表达转录激活子的启动子PFRL，DNA序列如SEQIDNO.4所示，和起始转录激活下游基因的转录激活子FGTA4，氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。(2)构建基因定位器。其中，基因定位器包括dCas9蛋白以及靶向分化成神经元的相关内源基因NEUROG2的sgRNA序列如SEQIDNO.6、7所示。本专利技术还提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统，其特征在于，所述系统包括：远红光调控基因表达环路控制系统和基因定位器。/n

【技术特征摘要】
1.一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统，其特征在于，所述系统包括：远红光调控基因表达环路控制系统和基因定位器。


2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述远红光调控基因表达环路控制系统能够诱导基因的转录表达。


3.如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述基因包括细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS、c-di-GMP的降解酶YhjH、BldD融合表达的激活子、BldD识别结合的启动子PFRL1b[(whiG)2-PhCMVmin3G]。


4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述c-di-GMP的降解酶YhjH的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述BldD融合表达的激活子的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；所述BldD识别结合的启动子PFRL1b[(whiG)2-PhCMVmin3G]的DNA序列如SEQIDNO.4所示。


5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述定位器能够有效靶向到目标基因的启动子位置，包括dCas9蛋白和具有指导靶向作用的所有的单链RNA，激活目标基因表达并诱导干细胞分化。


6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述dCas9蛋白可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因位点配对，启动任意外源基因的表达；其中，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


7.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述dCas9蛋白可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因启动子位点配...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶海峰，王美艳，邵佳伟，周阳，
申请(专利权)人：苏州欣赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32