高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法及菌株技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术涉及一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。本发明专利技术筛选获得的一株高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050。本发明专利技术的有益效果主要体现在：1、通过高通量筛选高产两性霉素B菌种的方法，能够方便快速高效地检测两性霉素B的产量，提高了诱变育种和基因工程菌株的筛选或验证效率。2、诱变育种获得的结节链霉菌N5，相对原始菌株N3，两性霉素B产量提高了20％，能够作为基因工程菌的原始菌株。3、通过过表达功能基因分别提高两性霉素B的产量，其中乙酰辅酶A羧化酶1(acc1)提高两性霉素B产量20％。4、卡那霉素价格优廉、抗菌谱广、杀菌作用强，适用于工业中使用，对于企业总体收益率有较强提高作用，以实验室5L罐为计算，能降低成本约2000元/罐。

【技术实现步骤摘要】
高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法及菌株(一)
本专利技术涉及一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。(二)
技术介绍
多烯大环内酯类抗生素是一类主要由链霉菌次级代谢产物组成的抗生素。该类抗生素具有广谱的抗真菌活性及很小的耐受性，成为目前为止最有效的抗真菌药物，广泛应用于治疗各类由真菌引起的感染性疾病。两性霉素B(AmphotericinB，AmB)首次发现于1955年，从委内瑞拉奥里诺科河水土样中的结节链霉菌(Streptomycesnodosus)中人们首次分离得到了两性霉素B。两性霉素B于1959年在结节链霉菌发酵液中提取获得，于1966年开始上市。两性霉素B是首个在临床上被应用于深部真菌感染的药物，至今仍然是不可代替的抗真菌药物。AmB具有广谱性的对真菌抗性，特别是对于具有生命威胁性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉属真菌等，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等。AmB多用于免疫系统损伤或免疫力较差患者，如器官移植接受者，HIV患者，以及使用抑制免疫力药物的肿瘤患者等。研究表明两性霉素B最初在真菌细胞膜上聚集并插入细胞膜形成一个V型的孔道，两性霉素B分子倾斜使得多烯内酯环上的末端OH基团朝向脂双层中心，但这个过程并没有固醇参与，且V型孔道不贯穿细胞膜，如图1。在这种构象中，V型孔道可以加载离子或小分子非电解质(如尿素)，但是直到短暂的“开放”状态(两性霉素B分子垂直于膜平面,允许溶质的扩散)才会发生离子穿膜。在两性霉素B浓度高于阈值时，脂双层的厚度进一步降低，固醇分子和两性霉素B分子共同形成跨膜孔道。值得注意的是固醇分子直接参与形成跨膜孔道，而不是协助V型孔道穿膜。细胞内的离子和小分子物质通过这些跨膜孔道大量流失造成细胞死亡。随着环境和生活水平的变化及耐药性的增强，真菌感染问题日益严峻，而近年来两性霉素B局部用药的提出和各类两性霉素B衍生药物的上市，降低了两性霉素B对人体的毒副作用，扩大了两性霉素B的应用范围。广阔的市场前景使研究两性霉素B提产仍有巨大的意义和经济价值。两性霉素B的化学结构复杂，目前多采用微生物发酵法生产，因此筛选优秀的两性霉素B高产菌株是比较重要的前体。目前对于获得高产菌株的方法一般为两大类：传统诱变育种和基因工程改造菌种。传统育种分为物理诱变、化学诱变、混合诱变及其他方法；基因工程改造菌种一般通过改变菌种内前体代谢的路径，能量代谢，切断竞争支路等方法来提高产量。同时两大类方法都需要一种高效便捷快速的高通量筛选方法来初步筛选，以提高育种或构建菌种的效率。抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法。抑菌圈法操作便捷、简单易行、成本低廉、结果准确可靠，被广泛用于抗生素等代谢产物菌种筛选的初筛。工具菌一般采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。(三)
技术实现思路
本专利技术目的本专利技术目的是一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的高产两性霉素B诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。本专利技术采用的技术方案是：高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，所述方法包括：(1)将结节链霉菌接种至GYM平板25～26℃培养5～7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心后去上清液，加入无菌水重悬后，离心、重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；(2)取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，25～26℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mLNTG的PBS缓冲液处理0.5h，离心，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株；(3)突变株涂布于GMY固体培养基上，26℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；(4)将酵母菌X33作为敏感菌株，接种于GYM液体培养基，28℃，200rpm培养24小时，涂布于GYM固体培养基；将结节链霉菌单菌落利用无菌打孔器或无菌200μL的枪头，打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布酵母X33的固体培养基，26℃培养20小时后，观测抑菌圈大小，筛选获得高产两性霉素B结节链霉菌。步骤(4)所获得的高产两性霉素B结节链霉菌，可重新作为初始菌株重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。本专利技术利用抑菌圈方法，由酵母菌作为敏感菌株，在琼脂平板上进行初步筛选，对于透明圈大于对照的菌种进行发酵，也可以利用高效液相色谱(HPLC)进行精确检测。本专利技术还涉及一株筛选获得的高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌ZJB2016050(StreptomycesnodosusZJB2016050)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年07月17日，保藏编号CCTCCNO：M2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术还涉及一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，由下列之一的外源基因导入前述结节链霉菌ZJB2016050(StreptomycesnodosusZJB2016050)获得：(1)SEQIDNO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因；(2)SEQIDNO.2所示乙酰辅酶A羧化酶2基因；(3)SEQIDNO.3所示聚酮合酶PKSamphA基因；(4)SEQIDNO.4所示甲基丙二酰辅酶A变位酶基因；(5)SEQIDNO.5所示甲基丙二酰辅酶A异构酶基因。优选的，所述外源基因为SEQIDNO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因。更为优选的，所述重组结节链霉菌为结节链霉菌ZJB2016050-ACC1(StreptomycesnodosusZJB2016050-ACC1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M2019343，保藏日期2019年05月09日。本专利技术还涉及所述结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。具体的，所述应用为：将所述产两性霉素B的结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO35～10g/L，KH2PO40.1～0.4g/L，溶剂为水，pH7.0。优选的，发酵培养基组成如下：葡萄糖70g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，所述方法包括：/n(1)将结节链霉菌接种至GYM平板25～26℃培养5～7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心后去上清液，加入无菌水重悬后，离心、重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；/n(2)取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，25～26℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mL NTG的PBS缓冲液处理0.5h，离心，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株；/n(3)突变株涂布于GMY固体培养基上，26℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；/n(4)将酵母菌X33作为敏感菌株，接种于GYM液体培养基，28℃，200rpm培养24小时，涂布于GYM固体培养基；将结节链霉菌单菌落利用无菌打孔器或无菌200μL的枪头，打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布酵母X33的固体培养基，26℃培养20小时后，观测抑菌圈大小，筛选获得高产两性霉素B结节链霉菌。/n...

【技术特征摘要】
1.高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)将结节链霉菌接种至GYM平板25～26℃培养5～7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心后去上清液，加入无菌水重悬后，离心、重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；
(2)取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，25～26℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mLNTG的PBS缓冲液处理0.5h，离心，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株；
(3)突变株涂布于GMY固体培养基上，26℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；
(4)将酵母菌X33作为敏感菌株，接种于GYM液体培养基，28℃，200rpm培养24小时，涂布于GYM固体培养基；将结节链霉菌单菌落利用无菌打孔器或无菌200μL的枪头，打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布酵母X33的固体培养基，26℃培养20小时后，观测抑菌圈大小，筛选获得高产两性霉素B结节链霉菌。


2.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)所获得的高产两性霉素B结节链霉菌，重新作为初始菌株重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。


3.由权利要求1所述方法筛选获得的高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌ZJB2016050(StreptomycesnodosusZJB2016050)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年07月17日，保藏编号CCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，黄恺，张博，姜圣贤，张雨函，陈燏，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33