黄酮合酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种黄酮合酶及其应用。所述黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。该黄酮合酶可实现包括芹菜素在内的多种黄酮化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率，具有优于现有种类的FNS I的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。

Flavone synthetase and its application

【技术实现步骤摘要】
黄酮合酶及其应用
本专利技术涉及生物酶
，特别涉及一种黄酮合酶，以及该黄酮合酶的应用。
技术介绍
黄酮类化合物是结构多样性高的重要植物天然化合物，目前已经分离到了9000多种不同结构的黄酮类化合物，按结构可以分为黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavone)、黄烷醇(flavanols)、黄酮醇(flavonols)和花青素(anthocyanidines)等不同类型。其中，黄酮是黄酮类化合物中最大的类型。黄酮不但对于植物的生理、生态和农业有广泛的用途，而且在癌症和心血管等疾病防治方面也显著的疗。例如，芹菜素(apigenin)是一种黄酮类化合物，分布于一些温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高。芹菜素具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种生物学活性，它的抗肿瘤活性非常优异，不但可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移而且可以提高化疗药物敏感性和抗氧化作用等(陈亭亭等，中国现代应用药学，2019年)。木犀草素(luteolin)也是一种存在于多种蔬菜和药用植物中的黄酮类化合物，具有包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保护神经系统等在内的多种药物活性(王继双等，生命科学，2013)。白杨素(chrysin)又是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，它即可从紫葳科植物木蝴蝶中提取，同时也是蜂胶的主要有效成分之一，具有抗肿瘤和防治心脑血管疾病等多种药理作用(姜金生等，中草药，2011年)。由于具有良好的药理活性使得黄酮在药物开发与设计方面也越来越受到重视(StefanMartens等，MoleculesofInterest，2005年)。因此，如何大量制备这些黄酮化合物也受到了越来越多的关注。黄酮的生物合成包括以下几个步骤，首先三个分子丙二酰辅酶A与一个分子对香豆酰基辅酶A或者一份子肉桂酰辅酶A或者一分子咖啡酰辅酶A等合成查尔酮衍生物，接着查尔酮衍生物转化为黄烷酮，最后黄烷酮在黄酮合酶(FNS)的催化下生成黄酮。在黄酮的生物合成途径中，黄酮合酶是其中的限速酶。目前已经发现植物中存在两种完全不同的FNS，其中一种是FNSI，它是一种可溶性双加氧酶，另外一种是FNSII，它是一种膜结合细胞色素P450酶。通过FNS的催化作用可以将很多低成本的黄烷酮化合物转化为药用价值更高的黄酮化合物，例如将柚皮素转化为芹菜素，圣草素(eriodictyol)转化为木犀草素和松果间素(pinocembrin)转化为木犀草素。经过文献比较分析，大部分FNSI的催化效率要高于FNSII(EffendiLeonard，APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2005)，但是现有种类的FNSI转化效率仍不能满足要求生产、科研需求。
技术实现思路
本技术公开的FNSI可实现包括芹菜素在内的多种黄酮化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率。本专利技术公开的黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的多肽；或(b)将SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。优选地，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。本专利技术同时还公开了编码上述黄酮合酶的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，含有前述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。在本专利技术的另一方面，提供上述黄酮合酶的制备方法，其包括步骤：1)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；2)从培养物中分离出黄酮合酶。制得的黄酮合酶可应用于将黄烷酮化合物转化为黄酮化合物。具体是以α酮戊二酸为辅因子将黄烷酮化合物合成黄酮类植物的小分子代谢产物；例如，将柚皮素转化为芹菜素。本专利技术公开的黄酮合酶具有优于现有种类的FNSI的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。附图说明图1为黄酮合酶DcFNS和AgFNS琼脂糖凝胶电泳图；图2为黄酮合酶DcFNS和AgFNS的westernblot图；图3为黄酮合酶DcFNS、AgFNS和PcFNS催化柚皮素反应产物的HPLC检测图；图4为黄酮合酶DcFNS、AgFNS和PcFNS催化柚皮素效率比较图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。通过对多种植物的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中分别获得黄酮合酶的核苷酸候选序列DcFNS(SEQIDNO:3)和AgFNS(SEQIDNO:4)。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以α酮戊二酸为辅因子，通过体外催化检测其对柚皮素的催化活性。本专利技术发现DcFNS和AgFNS表达产物能够高效催化柚皮素合成具有高附加值和多种重要生理活性的芹菜素。实施例1.黄酮合酶DcFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达合成如序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用AxygenGelExtractionKit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的黄酮合酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-DcFNS。经测序获得DcFNS的基因序列。DcFNS基因具有SEQIDNO:3的核苷酸序列。自SEQIDNO:3的5’端第1-1074位核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黄酮合酶，其特征在于，选自：/n(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或/n(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或/n(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.黄酮合酶，其特征在于，选自：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的多肽；或
(b)将SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。


2.根据权利要求1所述的黄酮合酶，其特征在于，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。


3.多核苷酸，其特征在于，选自：
(α)如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多核苷酸；或
(β)编码如权利要求1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，周金林，叶德晓，王平平，严兴，
申请(专利权)人：佛山市汇腾生物技术有限公司，中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44