一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用技术

一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域；所述突变体L283V/L286V的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示；为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：3所示的脱氢酶的第283位和第286位的的亮氨酸同时突变为缬氨酸。脱氢酶突变体L283V/L286V在全细胞体系催化麦斯明还原反应生成S

【技术实现步骤摘要】
一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]尼古丁（nicotine），俗称烟碱，是茄科植物烟草中所持有的生物碱，占烟草中全部生物碱的95%以上，其化学名为1
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甲基（2
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吡啶基）吡咯烷，分子式为C
10
H
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N2，是具有较强碱性的有机二元弱碱，能和多种无机酸或有机酸生成结晶的单盐或双盐，在烟叶中多以有机盐形式存在。
[0003]烟碱的用途十分广泛，烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想高效杀虫剂和生物性农药。它还广泛应用于医药工业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾病药物的特种原料。在临床研究中，尼古丁还对预防并治疗老年痴呆症（Alzheimer
’
s disease, AD）和帕金森氏综合症（Parkinson
’
s disease, PD）起积极作用。一些实验和临床结果显示，尼古丁可以影响AD中神经纤维缠结改变的程度，通过皮下和静脉给药可以改善AD病人的认知障碍，尤其是信息加工能力和短期记忆能力。
[0004]目前市场上使用的天然尼古丁（S
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尼古丁）主要还是依赖植物提取的方式，其中包括微波法、超声波提取法、超临界萃取法等。但是，植物提取的方法效率低，而且因为受到原材料、气候和生长周期等多方面的影响，提取尼古丁的过程中还会含有烟草特有的尼古丁相关杂质，这类杂质的长期使用会对健康产生潜在危害，通过植物提取获得的尼古丁还需要一系列纯化步骤才能获得高纯度的S
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尼古丁。因此，高效合成高纯度S
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尼古丁的制备方法被广泛关注。
[0005]S
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去甲烟碱（S
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nornicotine）是合成S
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尼古丁的重要前体物质，S
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去甲烟碱只需要一步甲基化反应即可生成S
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尼古丁，而高光学纯度的S
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去甲烟碱是合成高纯度S
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尼古丁的保证。
[0006]酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的一种生物催化剂；酶的高效性和专一性，使其在合成高纯度化合物中得到广泛应用。随着分子生物学、蛋白质工程等相关技术逐渐成熟，酶催化机理的解读手段以及酶的设计技术越来越丰富，利用生物酶法完成高光学纯度S
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去甲烟碱的合成是一种值得研究的方向。蛋白质工程理性设计是以定点突变技术为主要手段，根据对蛋白质结构与功能关系地了解，有目的地设计改造蛋白质，使其性能达到预期效果。目前，已有大量研究成功利用理性设计技术对天然酶的催化活性、底物特异性、热稳定性以及酶的别构效应等进行改造。随着计算生物学的发展，计算机辅助设计指导酶改造的方法日趋成熟。利用计算机模拟的方法，建立酶的三维结构模型，分析酶与底物的构象关系，快速定位与催化反应相关的区域，缩小突变库容量，高效获得相关靶点，为蛋白质工程改造提供指导。但是目前未发现通过蛋白质工程对酶进行设计和改造，实现利用生物酶法完成高光学纯度S
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去甲烟碱的合成的相关研究。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于设计并提供一种脱氢酶突变体L283V/L286V，用于制备S
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去甲烟碱，其底物多样性丰富且产物光学纯度高，且酶解时间短，转化率高。
[0008]本专利技术的目的之二在于提供上述脱氢酶突变体L283V/L286V的制备方法，通过定点突变技术制备脱氢酶突变体L283V/L286V，稳定性高。
[0009]本专利技术的目的之三在于提供上述脱氢酶突变体L283V/L286V在制备高光学纯度的S
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去甲烟碱中的应用。
[0010]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种脱氢酶突变体L283V/L286V，所述突变体L283V/L286V的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示。
[0011]进一步地，编码所述突变体L283V/L286V基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：2所示。
[0012]进一步地，所述突变体L283V/L286V为将氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的MesPDH酶的第283位和第286位的亮氨酸同时突变为缬氨酸所制成。
[0013]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种脱氢酶突变体L283V/L286V的制备方法，包括以下步骤：S1，将MesPDH酶基因连接到质粒中，得到重组质粒；S2，设计突变引物，采用突变引物并以所述重组质粒为模板进行PCR扩增，使MesPDH酶的第283位和第286位氨基酸同时突变为缬氨酸，酶切消化去除模板DNA后，回收得到突变产物；S3，将所述突变产物转化至宿主细胞中，培养，得到脱氢酶突变体L283V/L286V表达菌株，诱导表达，得到脱氢酶突变体L283V/L286V。
[0014]进一步地，所述MesPDH酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0015]进一步地，所述突变引物包括引物283/286
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F和引物283/286
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R；所述引物283/286
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F的序列如SEQ ID NO：5所示；所述引物283/286
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R的序列如SEQ ID NO：6所示。
[0016]进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0017]进一步地，步骤S2中，PCR扩增程序的反应条件为： 98℃预变性3min；然后循环设定为： 98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸2 min；30个循环后，72℃延伸10 min。
[0018]一种脱氢酶突变体L283V/L286V在制备高光学纯度的S
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去甲烟碱中的应用。
[0019]进一步地，所述脱氢酶突变体L283V/L286V用于特异性还原麦斯明制备高光学纯度的S
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去甲烟碱。
[0020]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的一种脱氢酶突变体L283V/L286V，通过定点突变技术将MesPDH酶的第283位和第286位氨基酸同时突变为缬氨酸构建，其结合全细胞生物体内的辅酶循环系统，能特异地还原麦斯明制备高光学纯度的S
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去甲烟碱，酶解时间短，转化率高。脱氢酶MesPDH的第283位亮氨酸（L283）和第286位亮氨酸（L286）的位置处于活性口袋内，酶的表面位置附近，通过与麦斯明、葡萄糖、葡萄糖酸、NAD+和NADH进行分子对接，这两个氨基酸均位于麦斯明、葡萄糖和葡萄糖酸附近区域且稍微远离NAD+和NADH。本专利技术通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱氢酶突变体L283V/L286V，其特征在于，所述突变体L283V/L286V的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种脱氢酶突变体L283V/L286V，其特征在于，编码所述突变体L283V/L286V的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的一种脱氢酶突变体L283V/L286V，其特征在于，所述突变体L283V/L286V为将氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的MesPDH酶的第283位和第286位的亮氨酸同时突变为缬氨酸所制成。4.一种权利要求1
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3任一项所述的脱氢酶突变体L283V/L286V的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，将编码MesPDH酶的基因连接到质粒中，得到重组质粒；所述MesPDH酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；S2，设计突变引物，采用突变引物并以所述重组质粒为模板进行PCR扩增，使MesPDH酶的第283位和第286位氨基酸同时突变为缬氨酸，酶切消化去除模板DNA后，回收得到突变产物；S3，将所述突变产物转化至宿主细胞中，培养，得到脱氢酶突变体L283V/L286V表达菌株，诱导表达，得到脱氢酶突变体L283V/L286V。5.根据权利要求4所述的一种脱氢酶突变体L283V/L286V的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄佳俊，李荣旭，江锐冰，吴子蓥，胡浩轩，白少钰，周金林，卢宇靖，
申请(专利权)人：佛山市汇腾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：