胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途制造技术

本发明专利技术涉及胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途，具体地涉及新的羟化酶、编码它的核酸序列、包含此序列的表达构建体和载体、用其转化的微生物和用于类异戊二烯的微生物羟化的方法，例如，用于将β

【技术实现步骤摘要】
胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途
[0001]本申请是申请日为2013年8月27日、名称为“胡萝卜素羟化酶及其用 于产生类胡萝卜素的用途”的中国专利技术专利申请201380066965.4的分案申请。
[0002]专利技术背景
[0003]本专利技术涉及新的羟化酶、编码它的核酸序列、包含此序列的表达构建体和 载体、用其转化的微生物、用于类异戊二烯的微生物羟化的方法，例如，用于 将β
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胡萝卜素转变成β
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隐黄素或玉米黄质以及将角黄素转变成虾青素的方法。
[0004]类胡萝卜素是颜色在黄色至红色范围内的有机色素，其由一些生物包括 光合生物(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌天然产生。
[0005]类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄质或虾青素是在人和牲畜饮食中作为色素 物质和维生素A衍生物的前体的非常重要的添加剂。此外，类胡萝卜素具有 促进健康的作用如增强免疫应答，而且由于其抗氧化剂特性的原因具有预防 癌症的作用，这使其用作感兴趣的保健品(nutraceutical)。因此用于制备类胡 萝卜素的经济方法和具有增加的类胡萝卜素含量的食品至关重要。用于制备 类胡萝卜素的特别经济的方法是生物技术方法，其利用来自产生类胡萝卜素 的生物的类胡萝卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。
[0006]经由β
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隐黄素催化β
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胡萝卜素酶法转变成玉米黄质的原核β
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胡萝卜素羟 化酶和编码这些蛋白的基因已知来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora) (Misawa等,J.of Bacteriology 1990,6704
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6712；EP 393690B1)、草生欧文氏菌 (Erwinia herbicola)(WO 9113078)、橙黄土壤杆菌(Agrobacterium aurantiacum) (Misawa等,J.of Bacteriology 1995,6575
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6584；EP 735 137A1)、产碱菌属菌种 (Alcaligenes sp.)PC
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1(EP 735 137A1)、黄杆菌属菌种(Flavobacterium sp.)菌株 R1534(Pasamontes等,Gene 1997,185,35
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41；EP 747483A2)和来自蓝藻集胞 藻属(Cyanobacterium Synechocystis)PCC6803(Masamoto等,Plant Cell Physiol. 1998,39(5),560
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564)。
[0007]还已知来自橙黄土壤杆菌、产碱菌属和噬夏孢欧文氏菌的原核β
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胡萝卜 素羟化酶还能够将角黄素经由金盏花红素(adonirubin)转变成虾青素(Misawa 等,J.of Bacteriology 1995,6575
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6584；Fraser等,J.Biol.Chem.1997,272, 6128
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6135)。
[0008]已知来自真核来源的三种植物β
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胡萝卜素羟化酶可催化β
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胡萝卜素经由 β
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隐黄素酶法转变成玉米黄质。相应的cDNA已从拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Cunningham等,J.Biol.Chem.1996,271,24349
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24352,WO 9736998)和辣椒 (Capsicum annuum L.)中分离。
[0009]真核来源的基因相对于原核基因具有优势，其在更高等的转基因生物如植 物中表达更佳。尽管如此，仍然需要改进和增加类胡萝卜素生产力用于通过将 真核核酸并入生物体而制备类胡萝卜素衍生物或具有增加的类胡萝卜素含量 的食品的方法。
[0010]此外，现有技术中适当的真核β
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胡萝卜素羟化酶具有它们仅有窄的底物 范围的缺点使得存在不能由羟化酶转变且可对羟化酶发挥抑制效果的代谢产 物的积累。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术的目标之一是改正现有技术的所述缺陷并提供具有改进特性的真 核胡萝
卜素羟化酶。
[0013]专利技术人发现通过包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的具有羟化类异戊二烯 (例如，β
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胡萝卜素或角黄素)酶活性的蛋白可令人惊讶地实现上述目标。
[0014]因此，本专利技术涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白或多肽，或源自 此序列通过氨基酸的取代、插入或缺失并与序列SEQ ID NO:2在氨基酸水平 具有至少50％同源性的序列。
[0015]特别地，根据本专利技术的羟化酶如果在所选的或能够产生特定类胡萝卜素 (例如玉米黄质或虾青素)的菌株中表达，与未用编码根据本专利技术的蛋白或多肽 的基因转化的菌株相比，可增加这些类胡萝卜素的水平。
[0016]本专利技术还涉及编码本专利技术的多肽的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸 的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生所述多肽的方法。
[0017]本专利技术还提供用于类胡萝卜素生物产生的改进系统。在一个优选的实例中， 本专利技术提供产生一种或多种类胡萝卜素的含油真菌(包括，例如，酵母)。本专利技术 还提供构建所述酵母和真菌的方法，使用这种酵母和真菌以产生类胡萝卜素的 方法，和制备包含类胡萝卜素的组合物(如食品或饲料添加剂，或营养补充剂) 的方法，使用所述含油酵母或真菌中产生的类胡萝卜素的方法。特别地，本发 明提供用于生成包含编码本专利技术多肽的多核苷酸的酵母和真菌的系统和方法。
[0018]序列表概述
[0019]SEQ ID NO:1是编码来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的低频胡 萝卜素羟化酶的未优化DNA序列。
[0020]SEQ ID NO:2是从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
[0021]SEQ ID NO:3是编码来自雨生红球藻的低频胡萝卜素羟化酶的DNA序列， 如对于在解脂耶氏酵母/解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)中表达而优化的。
[0022]SEQ ID NO:4是编码来自粉尘克罗诺杆菌(Cronobacter pulveris)(之前为 粉尘肠杆菌(Enterobacter pulveris)(Ep)的胡萝卜素羟化酶的DNA序列，如对 于在解脂耶氏酵母中表达而优化的。
[0023]SEQ ID NO:5是编码来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌DC404(Dc) 的胡萝卜素羟化酶的DNA序列，如对于在解脂耶氏酵母中表达而优化的。
[0024]定义
[0025]分离的多肽：术语“分离的多肽”意指相对于天然发现的多肽由人工进 行修饰的多肽。在一个方面中，所述多肽为至少1％纯，例如，至少5％纯、 至少10％纯、至少20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有类异戊二烯的微生物羟化的羟化酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列。2.权利要求1的多肽，其中所述蛋白具有以下酶活性：(a)用于将β
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胡萝卜素转变成β
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隐黄素和/或玉米黄质的酶活性，其中基于类胡萝卜素的总量，隐黄素的百分比是至少21％，和/或，(b)将角黄素转变成金盏花红素和/或虾青素的酶活性，其中基于类胡萝卜素的总量，虾青素的百分比是至少12％。3.一种编码权利要求1或2的多肽的分离的核酸。4.权利要求3的分离的核酸，其由SEQ ID NO:1或3描述的序列组成。5.一种核酸构建体或表达载体，其包含与一个或多个调控序列可操作连接的权利要求3或4的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主细胞中的产生。6.一种转化的微生物，其中表达权利要求5的核酸构建体。7.权利要求6的转化的微生物，其类胡萝卜素代谢不同于野生型。8.权利要求7的转化的微生物，其中所述微生物是含油株(oleaginous strain)。9.权利要求8的转化的微生物，其中所述含油株是解脂耶氏酵母(Ya...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：