一种表达α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母及其制备方法和应用技术

一种表达α‑L‑鼠李糖苷酶的毕赤酵母及其制备方法和应用，涉及生物医药领域；选自：糖苷酶(a)、糖苷酶(b)或糖苷酶(c)，所述糖苷酶(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述糖苷酶(b)为将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质；所述糖苷酶(c)为与SEQ ID NO:1氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质。本发明专利技术首次将来源于Aspergillus nidulans FGSC A4菌株的α‑L‑鼠李糖苷酶RhaE在毕赤酵母细胞中进行表达，可以高效专一的水解柚苷二氢查耳酮、柚苷、芦丁、新橙皮苷、朝藿定C等含鼠李糖基的化合物，有效的提高了产物的收率。

【技术实现步骤摘要】
一种表达α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶在毕赤酵母细胞中的制备方法。
技术介绍
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC3.2.1.40)是一类糖苷水解酶，主要属于GH13、GH28、GH78和GH106家族，能高效水解许多天然糖苷酶类化合物末端的鼠李糖基，如水解橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、槲皮苷(quercitrin)、朝藿定C(EpimedinC)和淫羊藿苷(Icarrin)等天然黄酮类糖苷化合物为橙皮素单葡萄糖苷(hesperetin7-O-glucoside)、普鲁宁(prunin)、异槲皮苷(isoquercitrin)、槲皮素(quercetin)、淫羊藿苷(Icarrin)和淫羊藿次苷I(IcarisideI)等。在动物组织、植物、酵母、真菌和细菌中均有发现α-L-鼠李糖苷酶，然而不同来源的α-L-鼠李糖苷酶其酶学性质也存在较大差异。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶具有底物特异性，主要是对于α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键，其中大部分鼠李糖苷酶对α-1,2糖苷键具有活性，其次是α-1,6糖苷键。对底物特异性及活性的原因主要是底物鼠李糖基的连接类型和结构的影响。如芦丁和橙皮苷都是α-1,6连接的鼠李糖基，但相同的α-L-鼠李糖苷酶的水解活性也存在差异，原因在于二糖苷的连接类型不一样，形成了不同的空间位阻。由于物种来源的差异，不同来源的α-L-鼠李糖苷酶水解反应的最适温度和pH也不一样，分子量和等电点也存在较大差异。α-L-鼠李糖苷酶能应用于食品业中柑桔类果汁的去苦，饮料风味改善以及食品添加剂的生产等。除了在食品领域的应用，α-L-鼠李糖苷酶还能应用于医药行业，如用于生产药物或者药物中间体以及对药物进行改性提高药效等。由于该酶具有良好的应用前景，因此国内外越来越多的研究者对其进行研究开发。黄酮类化合物在人体中被吸收的难易程度不同，主要是不同糖苷的存在影响黄酮类化合物的溶解性和生物活性，研究发现黄酮化合物在小肠中的吸收受到其带有糖苷的抑制，将黄酮类化合物中部分糖苷或者全部糖苷水解后，能被小肠更好的吸收，以此来提高黄酮类化合物在人体的生物利用率。酶法水解对鼠李糖苷类黄酮化合物的水解具有高效、专一、温和等特点，对黄酮鼠李糖苷的生物催化转化具有巨大的应用潜力和开发前景。目前商业化来源的α-L-鼠李糖苷酶制剂一般是来源于黑曲霉和青霉菌，原始菌株来源的α-L-鼠李糖苷酶制剂中含有葡萄糖苷酶、半乳糖糖苷酶等其它水解酶，在应用生产中容易产生副产物，不利用产物的纯化和生产。利用基因工程手段，将α-L-鼠李糖苷酶基因进行克隆得到基因重组菌，将其进行表达，分离纯化得到α-L-鼠李糖苷酶，能有效的将α-L-鼠李糖苷酶应用于工业的生物转化生产中。但是原始菌株发酵得到α-L-鼠李糖苷酶活力不高，且专一性低，酶制剂中含有其它杂酶，容易生产副产物，影响了主产物的收率和纯化。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶，可以高效专一的水解柚苷二氢查耳酮、柚苷、芦丁、新橙皮苷、朝藿定C等含鼠李糖基的化合物，没有其它副产物的产生，有效的提高了产物的收率。本专利技术的目的之二在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸，用于编码高效专一的α-L-鼠李糖苷酶。本专利技术的目的之三在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体。本专利技术的目的之四在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，得到的α-L-鼠李糖苷酶活力高且专一性高，酶制剂不含有其它杂酶，无副产物，主产物的收率和纯度高。本专利技术的目的之五在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶的在黄酮类化合物或萜类香气前体化合物生物催化转化的应用。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种α-L-鼠李糖苷酶，选自：糖苷酶(a)、糖苷酶(b)或糖苷酶(c)，所述糖苷酶(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；所述糖苷酶(b)为将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质；所述糖苷酶(c)为与SEQIDNO:1氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质。进一步地，所述糖苷酶(c)还包括：由糖苷酶(a)或糖苷酶(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。一种α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸，用于编码所述的糖苷酶(a)，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，含有所述的编码α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸片段插入表达载体pPIC9K获得重组质粒pPIC9K-RhaE。一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，用于制备所述的一种α-L-鼠李糖苷酶，将SEQIDNO.2所示的α-L-鼠李糖苷酶基因片段插入表达载体pPIC9K获得重组质粒pPIC9K-RhaE，将重组质粒转化宿主细胞后诱导表达，并通过后续分离而得。进一步地，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115细胞或毕赤酵母KM71H细胞。进一步地，α-L-鼠李糖苷酶的制备方法包括步骤如下：S1：合成经过密码子优化后的α-L-鼠李糖苷酶基因；S2：将α-L-鼠李糖苷酶基因与表达载体pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC9K-RhaE；S3：将重组质粒pPIC9K-RhaE用SalI酶线性化后电转化至毕赤酵母细胞中，筛选阳性克隆得到重组毕赤酵母细胞GS115-pPIC9K-RhaE或KM71H-pPIC9K-RhaE。S4：取步骤S3得到的重组毕赤酵母细胞添加适量浓度的诱导剂，于26℃-30℃下诱导表达，离心弃菌体，上清液经进一步纯化得到α-L-鼠李糖苷酶RhaE酶液。进一步地，所述诱导剂为甲醇。进一步地，所获得的α-L-鼠李糖苷酶RhaE酶液催化的温度范围为40℃-60℃，pH范围为3.5-6。所述α-L-鼠李糖苷酶在黄酮类化合物或萜类香气前体化合物生物催化转化的应用，具体在柚苷二氢查耳酮、柚苷、芦丁、新橙皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷提取物催化转化的应用。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次将来源于AspergillusnidulansFGSCA4菌株的α-L-鼠李糖苷酶RhaE在毕赤酵母细胞中进行表达，重组酶具有高效稳定水解α-1、α-1,2、α-1,6糖苷键的性能，能专一性水解柚苷二氢查耳酮为三叶苷、柚苷为普鲁宁、芦丁为异槲皮素、橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷、新橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷、朝藿定C为淫羊藿苷，没有其它副产物的产生，有效的提高了产物的收率。附图说明图1为重组质粒pPIC9K-RhaE的琼脂糖凝胶电泳图。图2为重组GS115-pPIC9K-AnRhaE阳性克隆鉴定图。图3为重组KM71H-pPIC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，选自：糖苷酶(a)、糖苷酶(b)或糖苷酶(c)，/n所述糖苷酶(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；/n所述糖苷酶(b)为将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质；/n所述糖苷酶(c)为与SEQ ID NO:1氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，选自：糖苷酶(a)、糖苷酶(b)或糖苷酶(c)，
所述糖苷酶(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述糖苷酶(b)为将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质；
所述糖苷酶(c)为与SEQIDNO:1氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有糖苷酶(a)水解活性的由糖苷酶(a)衍生的蛋白质。


2.如权利要求1所述的α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于：所述糖苷酶(c)还包括：由糖苷酶(a)或糖苷酶(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。


3.一种α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸，用于编码如权利要求1所述的糖苷酶(a)，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


4.一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，其特征在于：含有权利要求3所述的编码α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸片段插入表达载体pPIC9K获得重组质粒pPIC9K-RhaE。


5.一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，用于制备如权利要求1或2所述的一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于：将SEQIDNO.2所示的α-L-鼠李糖苷酶基因片段插入表达载体pPIC9K获得重组质粒pPIC9K-RhaE，将重组质粒转化宿主细胞后诱导表达，并通过后续分离而得。

【专利技术属性】
技术研发人员：叶德晓，黄佳俊，周金林，卢宇靖，林育成，李慧灵，林丽薇，邓诚，陈宏基，
申请(专利权)人：佛山市汇腾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44