具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于微生物发酵，特别是指一种具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用。是将壳聚糖酶生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基，调节发酵培养基的pH于温度为35℃‑37℃通气发酵；发酵中流加氨水控制pH，流加补入葡萄糖溶液控制培养基中葡萄糖浓度；当发酵培养基的OD

【技术实现步骤摘要】
具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用
本专利技术属于微生物发酵，特别是指一种具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用。
技术介绍
壳寡糖又名氨基葡萄糖，通过β-1-4糖苷键连接而成，由来源于虾蟹壳的壳聚糖生物降解得到的聚合度为2-20的功能性寡糖。是自然界唯一的带正电荷、阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖具有独特的生理活性和功能性，具有抑菌、抗癌、降血糖降血脂、调节内分泌、排除重金属等功能。由于壳寡糖水溶性好，功能作用大，生物活性高，近年来针对壳寡糖生产和应用的研究越来越受到重视。壳寡糖的制备的常用方法包括物理降解法、化学法和酶法。物理降解法反应不充分，收率低；化学降解法易水解出大量氨基葡萄糖单体，化学试剂易造成设备腐蚀和环境污染；酶降解法因反应条件温合，过程易控制，产物相对均一，环境污染小，具有较好的发展前景。壳聚糖酶是专一性水解壳聚糖的酶，可以催化水解壳聚糖的β-1-4糖苷键得到壳寡糖。1973年Monaghan首次发现了壳聚糖酶，经过近30年的研究发现，壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中。申请人检索的现有文献包括：如赵玉巧等通过优化XK-3壳聚糖酶菌株培养条件，得到壳聚糖酶活力为3430U/L，公开号为CN102816751A的专利文献中采用蜡状芽孢杆菌进行深层液体发酵，得到粗酶活性227U/ml，纯化的壳聚糖酶制剂酶活25000U/g。虽然现有壳聚糖酶工业化生产取得了许多成果，但还存在酶活力较低，应用性能较差，产物聚合度不可控，使用成本高等问题。为了进一步满足工业生产需求，开发研究生产工艺简单、酶活性高，制作壳寡糖操作简单、快速的壳聚糖酶势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用，选用壳聚糖酶生产菌种，并对发酵工艺进行优化，使本专利技术所制备的未经纯化的壳聚糖酶粗酶液具有较高的酶活，并能将壳聚糖降解制备成平均相对分子量＜1000的壳寡糖。本专利技术的整体技术构思是：具有高活性的壳聚糖酶，其特征在于其未经纯化的粗酶酶活≥683U/ml,未经纯化的粗酶能将壳聚糖降解制备成平均相对分子量≤1000的壳寡糖。具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，是将壳聚糖酶生产菌种接种至灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中培养制成含有壳聚糖酶的发酵液；包括如下步骤：A、壳聚糖酶生产菌种选用拉丁文名称为Escherichiacoli，保藏编号为CGMCCNo.19765的埃希氏大肠杆菌；B、调节接种后的发酵培养基的pH＝6.8～7.2，于温度为35℃～37℃的条件下进行通气发酵；发酵过程中通过流加氨水控制pH＝6.8～7.2，当发酵培养基中葡萄糖质量百分浓度＜0.5％时，流加补入葡萄糖溶液；C、当发酵培养基的OD600≥30时，加入浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养，同时将发酵温度降至30℃-33℃；当发酵液中酶活不再增长或发酵周期≤30小时发酵结束制成含有壳聚糖酶的发酵液；D、将步骤C中制备的含有壳聚糖酶的发酵液经高压均质、离心得到含有壳聚糖酶的粗酶液。本专利技术中的拉丁文名称为Escherichiacoli，保藏编号为CGMCCNo.19765的埃希氏大肠杆菌是这样获得的：申请人于河北省衡水市衡水湖湿地采样分离纯化后得到一株产壳聚糖酶的高产菌株，然后利用基因工程技术将壳聚糖酶基因于埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达，获得壳聚糖酶高产工程菌，于2020年5月6日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC，该菌种的保藏编号为CGMCCNo.19765。具有高活性的壳聚糖酶在壳寡糖制备中的应用。本专利技术的具体技术构思还有：步骤A中的发酵培养基采用如下原料组成：葡萄糖3.0％～4.0％；酵母粉2.0％～3.0％；蛋白胨1.0％～1.5％；氯化钠0.8％～1.5％；磷酸氢二钾0.5％～1.5％；磷酸二氢钾0.15％～0.3％；七水硫酸镁0.1％～0.5％；有机硅消泡剂0.05％～0.15％；余量为无菌水。步骤B中流加的葡萄糖溶液的质量百分浓度为0.3％～0.6％。步骤B中通气条件为通风量0.3vvm～0.7vvm，氨水的质量百分比浓度为25％～28％。步骤D中高压均质的条件是压力为45Mpa～65Mpa。还包括有一步骤E，该步骤的工艺条件如下：E、将步骤D中制备的含有壳聚糖酶的粗酶液通过微滤、超滤进行浓缩，以醇沉收集沉淀，得湿固酶。步骤E的工艺条件是：将步骤D制备的粗酶液通过0.1微米的微滤膜除杂，然后通过4000Dalton超滤进行浓缩，浓缩至原液的1/8～1/5，以体积百分比浓度90％～95％乙醇或异丙醇进行沉淀，在6000-10000转/分钟的条件下离心收集沉淀，得湿固酶。还包括有一步骤F，该步骤的工艺条件如下：F、将步骤E中制备的湿固酶进行低温真空干燥、低温粉碎后制成粉体高纯度壳聚糖酶。步骤F的工艺条件是：将步骤E中制成的湿固酶在温度为40℃～50℃条件下真空干燥，将干燥后的物料在温度不超过50℃的条件下粉碎制成粉体高纯度壳聚糖酶，纯化后的粉体高纯度壳聚糖酶酶活可达63000U/g。还包括一菌种活化步骤，是将壳聚糖酶生产菌种接种到LB培养基中，在温度为35-37℃、转速为170-200转/分钟条件下活化10～16小时。还包括一扩大培养步骤，是将活化后的壳聚糖酶生产菌种按按质量百分比为8％～12％接种至LB培养基中，在温度为35-37℃、转速为170-200转/分钟条件下活化10～16小时。具有高活性的壳聚糖酶在壳寡糖制备中的应用，包括如下工艺步骤：a、配制质量百分比浓度为4.0％～15.0％的壳聚糖溶液，用酸调壳聚糖溶液pH＝4.5～6.0，然后升温至50℃～60℃；b、将所制备的纯化后的壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的粗酶液配制成酶活为200u/ml～300u/ml的壳聚糖酶液；c、将步骤b中配制好的壳聚糖酶液按质量百分比为0.1％～0.5％的比例加入到步骤a中制成的壳聚糖溶液中，搅拌反应2～5小时；d、将步骤c中反应完成的反应液升温灭活后冷却至室温；e、将步骤d中制成的反应液用氢氧化钠溶液调pH＝7.0～8.0，经板框过滤、超滤、纳滤、喷雾干燥，得到平均相对分子量≤1000的壳寡糖。所述的步骤a中的酸采用乙酸、乳酸、盐酸中的一种或其结合。所述的步骤c中的搅拌转速为20-100转/分钟。所述的步骤d中的升温灭活的条件为温度85-95℃、时间20-40分钟。所述的步骤e中氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为5％-10％。为验证本专利技术的技术效果，申请人采用如下方法对本专利技术中所制备的壳聚糖酶以及其应用效果进行实验：1、参照《几丁质酶活性检测方法》(GB/T34799-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有高活性的壳聚糖酶，其特征在于其未经纯化的粗酶酶活≥683U/ml,未经纯化的粗酶能将壳聚糖降解制备成平均相对分子量≤1000的壳寡糖。/n

【技术特征摘要】
1.具有高活性的壳聚糖酶，其特征在于其未经纯化的粗酶酶活≥683U/ml,未经纯化的粗酶能将壳聚糖降解制备成平均相对分子量≤1000的壳寡糖。


2.根据权利要求1所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，是将壳聚糖酶生产菌种接种至灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中培养制成含有壳聚糖酶的发酵液；其特征在于包括如下步骤：
A、壳聚糖酶生产菌种选用拉丁文名称为Escherichiacoli，保藏编号为CGMCCNo.19765的埃希氏大肠杆菌；
B、调节接种后的发酵培养基的pH＝6.8～7.2，于温度为35℃～37℃的条件下进行通气发酵；发酵过程中通过流加氨水控制pH＝6.8～7.2，当发酵培养基中葡萄糖质量百分浓度＜0.5％时，流加补入葡萄糖溶液；
C、当发酵培养基的OD600≥30时，加入浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养，同时将发酵温度降至30℃-33℃；当发酵液中酶活不再增长或发酵周期≤30小时发酵结束制成含有壳聚糖酶的发酵液；
D、将步骤C中制备的含有壳聚糖酶的发酵液经高压均质、离心得到含有壳聚糖酶的粗酶液。


3.根据权利要求2中所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤A中的发酵培养基采用如下原料组成：
葡萄糖3.0％～4.0％；酵母粉2.0％～3.0％；蛋白胨1.0％～1.5％；氯化钠0.8％～1.5％；磷酸氢二钾0.5％～1.5％；磷酸二氢钾0.15％～0.3％；七水硫酸镁0.1％～0.5％；有机硅消泡剂0.05％～0.15％；余量为无菌水。


4.根据权利要求2中所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤B中流加的葡萄糖溶液的质量百分浓度为0.3％～0.6％。


5.根据权利要求2所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤B中通气条件为通风量0.3vvm～0.7vvm，氨水的质量百分比浓度为25％～28％。


6.根据权利要求2所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤D中高压均质的条件是压力为45Mpa～65Mpa。


7.根据权利要求2-6中任一项所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于还包括有一步骤E，该步骤的工艺条件如下：
E、将步骤D中制备的含有壳聚糖酶的粗酶液通过微滤、超滤进行浓缩，以醇沉收集沉淀，得湿固酶。


8.根据权利要求7所述的具有高活性的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤E的工艺条件是：将步骤D制备的粗酶液通过0.1微米的微滤膜除杂，然后通过4000Dalton超滤进行浓缩，浓缩至原液的1/8～1/5，以体积百分比浓度9...

【专利技术属性】
技术研发人员：乞锋辉，杨晓民，刘学珍，脱世华，靳晓伟，
申请(专利权)人：河北沣川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13