具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶制造技术

本发明专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶。本发明专利技术所提供的解聚酶能够有效分解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物，从而利于能够杀伤该菌的药物与该菌进行接触进而发挥药效。

【技术实现步骤摘要】
具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶
本专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶。
技术介绍
肺炎克伯菌是一种革兰氏阴性的具有荚膜包被的肠道细菌，是最常见的机会致病菌，可引起广泛的医院感染，包括败血症、肺炎、尿路感染(UTI)和肝脓肿。近年来，肺炎克雷伯菌也作为一种潜在的社区获得性病原体，是世界各地特别是亚洲范围内，社区获得性肝脓肿的重要原因。在大量使用抗生素的情况下，肺炎克雷伯菌的多重耐药现象在过去十年中越来越多地出现在医院中。自2013年以来，肺炎克雷伯菌已被公认为碳青霉烯类耐药肠杆菌科(CRE)的主要成员，具有多耐药表型，并作为一类耐抗生素细菌，目前急需新的治疗方法。多糖是肺炎克雷伯菌最重要的致病因子之一，可在细胞周围形成荚膜多糖(CPS)或作为胞外多糖(EPS)释放。荚膜多糖(CPS)由4-6个单糖和糖醛酸组成的荚膜重复单位，通过血清型分型方法，肺炎克雷伯菌目前可分为至少78个荚膜血清型。CPS主要用于在感染过程中协助细菌逃避宿主免疫系统的检测，保护细菌免受调理吞噬和血清杀伤作用，并赋予其对抗生素的内在抵抗力。此外，它还可以作为物理屏障防止环境中的有害元素和噬菌体的入侵。噬菌体疗法作为一种新的治疗方法，在耐抗生素细菌感染方面得到了越来越多的关注。最近，噬菌体衍生的荚膜解聚酶正成为治疗肺炎克雷伯菌感染的一种替代药物。多糖解聚酶通常位于噬菌体尾部或基板的尖端，主要用于消化细菌荚膜多糖，促进细胞进一步感染。该酶的结构特点主要是同源三聚体结构。由于具有丰富的螺旋结构，酶的活性非常稳定。这些酶主要作用于CPS的糖苷键，通过释放糖聚合物的重复单位来破坏荚膜，使细菌失去其自然屏障，因此，更容易受到宿主免疫系统的攻击。研究发现解聚酶可以通过降解多糖来降低革兰氏阴性肠道细菌，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼氏菌的毒力，增强血清对细菌的体外杀灭作用。实验表明，解聚酶在体内也能发挥功能，在解聚酶治疗后，分别提高了被感染的小鼠和大蜡螟幼虫的存活率。因此，噬菌体解聚酶与其他治疗药物的结合为治疗细菌感染带来了新的曙光。在本专利技术申请人之前的工作中，经过大量筛选，曾意外地获得能够裂解肺炎克雷伯菌胞外聚合物的解聚酶Dpo42、Dpo43(公开号CN111481660A，优先权日2020年04月20日，公开日2020年08月04日)；这两种解聚酶能够有效裂解肺炎克雷伯菌K47的胞外聚合物。最近，在CRKP菌株中，K64被鉴定为比K47更为常见的荚膜型，在巴西、新加坡、中国台湾、美国和欧洲中均有发现。但是，噬菌体具有非常特异的宿主谱，且Dpo42、Dpo43的裂解能力同样是特异的，它们对K64荚膜型的肺炎克雷伯菌胞外聚合物难以产生令人满意的裂解作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术第一方面在于提供一种解聚酶，其具有SEQIDNO:1所示序列，或是与之具有至少80％同源性且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性、来源于肺炎克雷伯杆菌噬菌体的酶。本专利技术第二方面在于提供一种核酸，其编码如上所述的解聚酶。本专利技术还包括包含所述核酸的载体。本专利技术第三方面在于提供一种宿主细胞，其含有如上所述核酸，和/或如上所述载体。本专利技术第四方面在于提供一种肺炎克雷伯杆菌噬菌体，其能够表达如上所述解聚酶。本专利技术第五方面在于提供一种制备解聚酶的方法，其包括：1)培养如上所述的宿主细胞，2)表达所述解聚酶，3)由所述宿主细胞分离所述解聚酶；或；1')以K64荚膜型肺炎克雷伯菌为底物培养如上所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体，2')裂解所述K64荚膜型肺炎克雷伯杆菌噬菌体并分离所述解聚酶。本专利技术第六方面在于提供一种药物组合物，其包括：i)如上所述解聚酶，或如上所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体；以及ii)任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。本专利技术第七方面在于提供一种治疗肺炎克雷伯菌所导致的疾病的方法，所述方法包括对宿主给予有效量的如上所述的药物组合物的步骤。本专利技术的有益效果为：本专利技术所提供的解聚酶能够有效分解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物，从而利于能够杀伤该菌的药物与该菌进行接触进而发挥药效。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中噬菌体SH-KP152410在Kp2410双层琼脂平板上形成的噬菌斑和晕圈；图2为本专利技术一个实施例中噬菌体SH-KP152410的透射电镜图片；图3为本专利技术一个实施例中噬菌体SH-KP152410的基因组分析；图4为本专利技术一个实施例中ORF41的基因结构分析；图5为本专利技术一个实施例中重组SUMO-Dpo41融合蛋白经过Ni柱纯化后SDS-PAGE电泳图M：蛋白marker；泳道1：收集到的融合蛋白SUMO-Dpo41；泳道2-4：酶切后的目的蛋白Dpo41；图6为本专利技术一个实施例中梯度稀释的Dpo41对宿主菌Kp2410的点滴实验，其中PBS为对照；图7为本专利技术一个实施例中Dpo41孵育后的Kp2410胞外多糖的SEC-HPLC分析；Ⅰ表示纯化的Kp2410胞外多糖，Ⅱ表示37℃下，Dpo41孵育后Kp2410胞外多糖，Ⅲ表示25℃下，Dpo41孵育后Kp2410胞外多糖，Ⅳ表示37℃下，SUMO蛋白孵育后Kp2410胞外多糖；图8为本专利技术一个实施例中pH和温度对解聚酶活性和稳定性的影响；A不同pH对酶活性的影响；B不同温度对酶活性的影响；C不同pH下酶活的稳定性；D不同温度下酶活的稳定性；图9为本专利技术一个实施例中多糖解聚酶处理后的血清杀伤实验；Control：Kp2410；enzyme：Kp2410+Dpo41；Control-75％：Kp2410+75％血清；enzyme-75％：Kp2410+Dpo41+75％血清。本申请提供的肺炎克雷伯杆菌噬菌体(Klebsiellapneumoniaebacteriophage)，毒株名为SH-KP152410，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保存编号GDMCCNo：61131，该毒株于2020年8月8日由保藏中心收到并登记入册；经保藏中心于2020年8月12日检测为存活毒株。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.解聚酶，其具有SEQ ID NO:1所示序列，或是与之具有至少80％同源性且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性、来源于肺炎克雷伯杆菌噬菌体的酶。/n

【技术特征摘要】
1.解聚酶，其具有SEQIDNO:1所示序列，或是与之具有至少80％同源性且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性、来源于肺炎克雷伯杆菌噬菌体的酶。


2.根据权利要求1所述的解聚酶，所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体的保藏编号为GDMCCNo：61131。


3.根据权利要求1或2所述的解聚酶，其在pH＝5～9之间具有解聚酶活性。


4.根据权利要求1或2所述的解聚酶，其在25℃～70℃之间具有解聚酶活性。


5.编码权利要求1～4任一项所述解聚酶的核酸。


6.根据权利要求5所述的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


7.包含权利要求6所述核酸的载体，例如表达载体。


8.宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求5或6所述的核酸，和/或如权利要求7所述的载体。


9.肺炎克雷伯杆菌噬菌体，其能够表达权利要求1～4任一项所述解聚酶。


10.根据权利要求9所述的肺炎克雷伯杆菌噬菌体，其保藏编号为GDMCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝先潮，何平，李佳茵，杜娟，
申请(专利权)人：上海瑞宙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31