一种查耳酮异构酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种查耳酮异构酶突变体，该查耳酮异构酶突变体可以实现逆向催化二氢黄酮转化为查耳酮及其组合物，酶转化催化效率最高达99.36%；本发明专利技术公开的一种查耳酮异构酶突变体的制备方法，通过定向进化手段对查耳酮异构酶进行随机突变，构建突变库后以高通量的筛选手段快速鉴定，成本低廉且操作简便；本发明专利技术公开的一种查耳酮异构酶突变体在制备查耳酮组合物中的应用，利用查耳酮异构酶突变体催化转化二氢黄酮制备含查耳酮含量0.01%~99%的组合物。合物。合物。

【技术实现步骤摘要】
一种查耳酮异构酶突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程领域，尤其涉及一种查耳酮异构酶突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]黄酮类化合物是一类多酚类次生代谢物质，在植物生长发育中有着重要的生理作用，参与紫外线防护、抗病原微生物、花色形成、植物育性、植物与微生物相互识别协作等。查耳酮属于黄酮类化合物中的一种，天然存在的查耳酮存在潜在的抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化和抗寄生虫特性，并且具有独特的化学结构，因此促进了许多针对查尔酮衍生物的合成的研究。在植物体内，查尔酮是大部分类黄酮的重要前体，由苯丙烷酸途径产生的香豆酰辅酶A经丙二酰辅酶A延长碳链再环化生成。目前，工业上通过对在氢氧化钠的催化下由苯甲醛与苯乙酮的羟醛缩合反应来制备查耳酮。
[0003]然而，通过生物途径合成查耳酮的方法，目前仍未发现有关报道。植物中合成查耳酮的前体香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A原料价格昂贵，成本高，不适合大量制备查耳酮。查耳酮和与二氢黄酮之间属于异构化关系，因此考虑通过二氢黄酮的构象转换来制备查耳酮。查耳酮异构酶则是这两者转化的关键催化酶。查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI，EC 5.5.1.6）通过催化分子发生内环化反应，使双环的查耳酮转化为有生物学活性的三环（2S）
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黄烷酮，而该步骤也可以在没有查耳酮异构酶的条件下在植物体内缓慢自发进行，但在查耳酮催化下可使该反应的反应速率提高107倍。因此，需要提供一种高效转化二氢黄酮为查耳酮的新型查耳酮异构酶。
专利技术内容
[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一目的在于提供一种查耳酮异构酶突变体，其能解决目前查耳酮异构酶催化转化效果不佳的问题。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供一种查耳酮异构酶突变体的制备方法，其能解决目前查耳酮异构酶制备成本高和高转化的查耳酮异构酶制备困难的问题。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供一种查耳酮异构酶突变体的应用，其能解决目前二氢黄酮转化为查耳酮的问题。
[0007]本专利技术的第一个目的采用以下技术方案实现：一种查耳酮异构酶突变体，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶进行定向进化所获得的突变体。
[0008]进一步地，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶的第120位的色氨酸突变成组氨酸。
[0009]进一步地，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶的第183位的亮氨酸突变成酪氨酸。
[0010]进一步地，所述查耳酮异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0011]进一步地，所述查耳酮异构酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0012]本专利技术的第二个目的采用以下技术方案实现：一种查耳酮异构酶突变体的制备方法，包括以下步骤：S1、设计随机突变引物对查耳酮异构酶基因进行易错PCR，获得随机突变的查耳酮异构酶基因；S2、根据步骤S1获得的随机突变的查耳酮异构酶基因，构建突变文库；S3、对步骤S2获得的突变文库进行高通量筛选后，构建高表达工程菌株，得到查耳酮异构酶突变体。
[0013]进一步地，所述步骤S2中，将随机突变的查耳酮异构酶基因连接到质粒中，得到重组质粒后转化至宿主细胞中获得拟转化子，所述拟转化子组成突变文库。
[0014]进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌或酿酒酵母。
[0015]进一步地，步骤S1中，所述随机突变引物包括随机突变上游引物CmCHI
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F和随机突变下游引物CmCHI
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R；所述随机突变上游引物CmCHI
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述随机突变下游引物CmCHI
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R的核苷酸序列和SEQ ID NO：6所示。
[0016]本专利技术的第三个目的采用以下技术方案实现：一种查耳酮异构酶突变体在制备查耳酮中的应用，所述查耳酮异构酶突变体将二氢黄酮催化转化为查耳酮含量在0.01%~99%的组合物。
[0017]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的一种查耳酮异构酶突变体，可以实现逆向催化二氢黄酮转化为查耳酮及其组合物，该突变体的酶催化转化效率高，异构化处理仅需24h，在以黄酮类化合物（柚皮素、柚苷、橙皮苷、新橙皮苷或甲基橙皮苷）作为底物生成相应查耳酮时转化率高达71.30%
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99.36%。
[0018]本专利技术的一种查耳酮异构酶突变体的制备方法，通过定向进化手段对查耳酮异构酶进行随机突变，构建突变库后以高通量的筛选手段快速鉴定转化效果提升的突变体，进行多轮的突变筛选，成本低廉且操作简便，无需使用昂贵的香豆酰辅酶A或者有毒的苯乙酮/苯甲醛进行反应。
[0019]本专利技术的一种查耳酮异构酶突变体在制备查耳酮组合物中的应用，利用查耳酮异构酶突变体催化转化二氢黄酮制备含查耳酮含量0.01%~99%的组合物。
附图说明
[0020]图1为突变库筛选96孔板反应强度图（M326为本专利技术的突变体CmCHI
M
)。
[0021]图2为大肠杆菌系统柚皮素转化为柚皮素查耳酮液相检测结果图。
[0022]图3为大肠杆菌系统柚苷转化为柚苷查耳酮液相检测结果图。
[0023]图4为大肠杆菌系统橙皮苷转化为橙皮苷查耳酮液相检测结果图。
[0024]图5为大肠杆菌系统新橙皮苷转化为新橙皮苷查耳酮液相检测结果图。
[0025]图6为大肠杆菌系统甲基橙皮苷转化为甲基橙皮苷查耳酮液相检测结果图。
[0026]图7为酿酒酵母系统柚苷转化为柚苷查耳酮液相检测结果图。
具体实施方式
[0027]下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的部分实施例，而不是全部实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例定向进化是蛋白质工程技术中的其中一个关键技术，是在不了解有关酶结构与功能之间的关系等信息的情况下通过对蛋白基因的随机突变或基因片段的重组来创造突变库,然后通过高通量的筛选手段鉴定性能改善的突变体,挑出的有益突变基因可以作为下一轮突变的模板,进行多轮突变和筛选,以进一步提高酶的性能。这项技术是对酶的催化功能进行反转设计的有力工具。本专利技术采用定向进化技术，对查耳酮异构酶进行定向进化，使其具备有二氢黄酮催化生成查耳酮的反转功能，并利用该突变体实现查耳酮的生物制备。
[0028]下面，结合附图和具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
[0029]实施例1查耳酮异构酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种查耳酮异构酶突变体，其特征在于，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶定向进化所获得的突变体。2.根据权利要求1所述的一种查耳酮异构酶突变体，其特征在于，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶的第120位的色氨酸突变成组氨酸。3.根据权利要求2所述的一种查耳酮异构酶突变体，其特征在于，所述查耳酮异构酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的查耳酮异构酶的第183位的亮氨酸突变成酪氨酸。4. 根据权利要求1所述的一种查耳酮异构酶突变体，其特征在于，所述查耳酮异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。5. 根据权利要求4所述的一种查耳酮异构酶突变体，其特征在于，所述查耳酮异构酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。6.权利要求1
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5任一项所述的一种查耳酮异构酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、设计随机突变引物对查耳酮异构酶基因进行易错PCR，获得随机突变的查耳酮异构酶基因；S2、根据步骤S1获得的随机突变的查耳酮异构酶基因，构建突变文库；S3、对步骤S2获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄佳俊，李荣旭，周金林，白少钰，胡浩轩，罗冬章，鲍雅丹，
申请(专利权)人：佛山市汇腾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：