本发明专利技术涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种提高蔗糖异构酶热稳定性的突变体及其重组菌株。所述蔗糖异构酶突变体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。所述蔗糖异构酶突变体是在分散泛菌(Pantoea dispersa)来源的野生型蔗糖异构酶的基础上，发生第199位氨基酸由Ala突变成Leu获得的，其热稳定性较野生型提高了32.51％。利用本发明专利技术中的蔗糖异构酶突变体进行催化实验，催化产物中异麦芽酮糖的纯度可达到100％。本发明专利技术为蔗糖异构酶工业化应用方面奠定了基础。发明专利技术为蔗糖异构酶工业化应用方面奠定了基础。发明专利技术为蔗糖异构酶工业化应用方面奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种蔗糖异构酶突变体及其应用
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[0001]本专利技术涉及酶工程
，尤其涉及一种提高蔗糖异构酶热稳定性的突变体及其重组菌株。
技术介绍
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[0002]异麦芽酮糖，又名帕拉金糖，是具有还原性的二糖，由葡萄糖和果糖通过α
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1,6
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糖苷键链接形成，天然存在于甜菜、糖蜜和糖浆等。通常采用蔗糖异构酶催化制得，与蔗糖互为同分异构体，但两者性质却有所不同。与蔗糖相比，异麦芽酮糖甜度低、熔点低、粘度低、不易吸湿、稳定性强。异麦芽酮糖还具有优良的生理功能：(1)易于吸收，安全性高；(2)适合三高及肥胖人群的食用；(3)提升注意力；(4)非龋齿性，防止蛀牙；(5)不致腹泻；(6)不引起血糖的上升；(7)抗疲劳；(8)抑味剂，可作为益生元添加到功能食品中，提高功能食品的营养价值。
[0003]各国科研人员已经发现多种能够合成蔗糖异构酶的微生物，如异麦芽酮糖主产型(65％
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85％)的普城沙雷氏杆菌属(Serratia plymuthica)、分散泛菌属(Pantoea dispersa)、红色精朊杆菌属(Protaminobacter rubrum)、肠杆菌属(Enterobactersp.)、大黄欧文氏菌属(Erwinia rhapontici)和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)；以及海藻酮糖主产型(85％
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90％)的嗜中酸假单胞菌属(Pseudomonas mesoacidophila)和放射性土壤杆菌属(Agrocbacterium radiobacter)。目前表达蔗糖异构酶酶活力较高的宿主主要是大肠杆菌、红色精朊杆菌等非食用安全菌，用于食品生产具有安全隐患，且酶自身热稳定性差，导致蔗糖异构酶难以在工业上进行连续的酶转化以及酶的储藏运输，致使异麦芽酮糖的酶法制备成本高居不下，无法规模化应用。
技术实现思路
：
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的为提供一种提高蔗糖异构酶热稳定性的突变体及其重组菌株和应用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种蔗糖异构酶突变体，所述蔗糖异构酶突变体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。所述蔗糖异构酶突变体是在分散泛菌(Pantoea dispersa)来源的野生型蔗糖异构酶的基础上，发生第199位氨基酸由Ala突变成Leu获得的，所述野生型蔗糖异构酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0007]本专利技术还提供所述蔗糖异构酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种包含上述蔗糖异构酶突变体的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体采用的表达质粒为pWB980。
[0009]本专利技术还提供了一种包含上述蔗糖异构酶突变体的编码基因的重组菌，所述重组菌通过将上述重组表达载体转入到宿主菌中进行表达获得；
No.3中野生型的氨基酸序列编号。
[0029]在本专利技术中，Sim表示野生型蔗糖异构酶，Sim
‑
T表示蔗糖异构酶突变体，信息如下表：
[0030][0031]其中，突变体Sim
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T的氨基酸序列SEQ ID NO.1如下：
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
[0033]2、本专利技术所用培养基：
[0034](1)LB培养基：每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，固体培养基加入琼脂18g，其他成分一致。
[0035](2)发酵培养基：每升含有玉米粉64g，豆粕粉40g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.3g，70mg高温淀粉酶。
[0036](3)枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：
[0037]SP
‑
A盐溶液：(NH4)2SO
4 4g/L，K2HPO4·
3H2O 28g/L，KH2PO
4 12g/L，柠檬酸钠2g/L；
[0038]SP
‑
B盐溶液：MgSO4·
7H2O 0.4g/L；
[0039]100
×
CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L；
[0040]SPI(200mL)：SP
‑
A盐溶液98mL，SP
‑
B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100
×
CAYE 2mL；
[0041]SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl
2 6mL，250mmol/LMgCl
2 6mL；
[0042]100
×
EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。
[0043](4)解淀粉芽胞杆菌感受态溶液制备：
[0044]LBS：每升含有山梨醇91.085g，氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g；
[0045]洗涤缓冲液：每升含有山梨醇91.085g，甘露醇91.085g，10％甘油100ml；
[0046]重悬缓冲液：每升含有山梨醇91.085g，甘露醇91.085g，10％甘油100mL，14％PEG 6000 140g。
[0047]3、本专利技术采用的蔗糖异构酶酶活单位(U)定义：在35℃，pH 6.0条件下，每分钟转化蔗糖生成1μmol异麦芽酮糖所需要的酶量定义为1U。
[0048]酶活测定方法：将发酵上清液(即粗酶液)用pH6.0磷酸氢二钠
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柠檬酸缓冲液，稀释到合适浓度，取稀释好的粗酶液20本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述蔗糖异构酶突变体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述蔗糖异构酶突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。4.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体或重组菌株。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，采用的表达质粒为pWB980。6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主菌为解淀粉芽孢杆菌CGMCC No....
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，王茂军，张宝伟，聂培旭，刘鹏，史超硕，李庆刚，路福平，
申请(专利权)人：茂德科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：
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