一种D-来苏糖异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
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来苏糖异构酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶工程领域，尤其涉及一种D
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来苏糖异构酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]现有随着现代社会的发展，生活水平的提高，人们开始关注功能性糖及其在健康方面的应用。功能性糖作为蔗糖替代剂，因其独特的生理功能，在食品、制药和保健等领域有广阔的前景。其中，D
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甘露糖作为功能性糖之一，还唯一用于在临床上的糖质营养素，且广泛分布于体液和组织中，尤其是在神经、皮肤、睾丸、视网膜、肝和肠。其直接被利用合成糖蛋白，参与免疫调节。其在人体内生理效应包括1)调节免疫系统，2)巨噬细胞表面有4种接受器可以捕捉抗原，都有甘露糖成分，3)增加伤口愈合，4)抗发炎效果，5)抑制肿瘤生长与转移，减少癌症存活率，6)可以避免某些细菌感染，如泌尿道感染，7)是合成维生素、抗肿瘤药物和免疫刺激药物的重要前体物质之一。因此，研究提高D
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甘露糖生产效率的生物催化剂尤为重要。
[0003]目前在功能性糖生产中，工业上对醛酮糖异构酶的性能有着诸多要求：底物特异性高；热稳定性强；催化效率高；弱酸稳定性强，而目前已报道10余种D
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来苏糖异构酶(D
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LIase)可用于D
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甘露糖的制备，但已有的D
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LIase热稳定性均不强，不利于工业化生产利用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种D
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>来苏糖异构酶突变体及其应用，旨在解决现有的D
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来苏糖异构酶突变体热稳定性不强且不利于工业化生产利用的技术问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供一种D
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来苏糖异构酶突变体，所述D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的氨基酸序列发生突变获得，突变位点包括第21，58，78，119和170位氨基酸中的至少两个位点进行突变。
[0006]可选地，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸和第78位的谷氨酸替换为脯氨酸；
[0007]或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，SEQ ID No.5所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸、第78位的谷氨酸替换为脯氨酸和第119位的半胱氨酸替换为酪氨酸；
[0008]或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，SEQ ID No.7所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸、第78位的谷氨酸替换为脯氨酸、第119位的半胱氨酸替换为酪氨酸和第21位的天冬酰胺替换为甘氨酸；
[0009]或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，SEQ ID No.9所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬
氨酸替换为酪氨酸、第78位的谷氨酸替换为脯氨酸、第119位的半胱氨酸替换为酪氨酸、第21位的天冬酰胺替换为甘氨酸和第170位的赖氨酸替换为脯氨酸。
[0010]此外，本专利技术还提供编码上述任一项所述D
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来苏糖异构酶突变体的基因，编码如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0011]或者，编码如SEQ ID No.5所示氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0012]或者，编码如SEQ ID No.7所示氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0013]或者，编码如SEQ ID No.9所示氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0014]此外，本专利技术还提供包含上述所述的编码基因的载体。
[0015]此外，本专利技术还提供含有上述编码基因的基因工程菌，所述基因工程菌为重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了权利要求上述任一项所述的D
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来苏糖异构酶突变体。
[0016]此外，本专利技术还提供一种制备如上述任一项所述D
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来苏糖异构酶突变体的方法，所述方法包括以下具体步骤：
[0017](1)将编码D
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来苏糖异构酶突变体的基因连接到表达载体上，得到重组的表达载体；
[0018](2)将表达载体转入宿主，培养宿主，使得宿主表达D
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来苏糖异构酶突变体；
[0019](3)从宿主培养液中分离纯化D
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来苏糖异构酶突变体。
[0020]此外，本专利技术还提供一种上述任一项所述D
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来苏糖异构酶突变体在制备D
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甘露糖中的应用。
[0021]可选地，所述D
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来苏糖异构酶突变体的制备温度为65℃，pH值为6.5。
[0022]此外，本专利技术还提供一种上述所述的载体在制备D
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甘露糖中的应用。
[0023]此外，本专利技术还提供一种上述所述的基因工程菌在制备D
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甘露糖中的应用。
[0024]有益效果：
[0025](1)本专利技术得到了一个热稳定性和酶活都显著提升的M2、M3、M4、M5多点突变体，在相同的酶反应条件下M2、M3、M4、M5突变体体系中D
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甘露糖的转化率明显高于野生酶WT体系中D
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甘露糖的转化率。
[0026](2)野生酶在65℃条件下孵育4小时左右，酶活下降到初始酶活的30％左右，而M2、M3、M4、M5还保留50％以上的酶活，直至22小时时，M2、M3、M4才降低至30％左右，而M5突变体在孵育22小时后，残留酶活依然为野生型初始酶活的1.5倍，且保留其本身初始酶活的53％左右。
[0027](3)突变体酶M2、M3、M4、M5的热稳定性较野生型的有显著的提升，此结果满足了D
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来苏糖异构酶工业化应用的诉求。
附图说明
[0028]图1为野生酶与M2、M3、M4、M5多点突变体在65℃孵育条件下不同反应时间的酶活对比图；
[0029]图2为图1所示的野生酶和多点突变体酶活拟合后的半衰期本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
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来苏糖异构酶突变体，其特征在于，所述D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的氨基酸序列发生突变获得，突变位点包括第21，58，78，119和170位氨基酸中的至少两个位点进行突变。2.根据权利要求1所述的D
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来苏糖异构酶突变体，其特征在于，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，SEQ IDNo.3所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸和第78位的谷氨酸替换为脯氨酸；或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，SEQ ID No.5所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸、第78位的谷氨酸替换为脯氨酸和第119位的半胱氨酸替换为酪氨酸；或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，SEQ ID No.7所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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来苏糖异构酶的第58位的缬氨酸替换为酪氨酸、第78位的谷氨酸替换为脯氨酸、第119位的半胱氨酸替换为酪氨酸和第21位的天冬酰胺替换为甘氨酸；或者，所述D
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来苏糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，SEQ ID No.9所示的D
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来苏糖异构酶突变体是由SEQ ID No.1所示的D
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊，易明，程云辉，文李，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：